Ultrasonido enfocado de alta intensidad para bloquear los potenciales de acción nerviosa en un modelo de rata diabética

Fuente: Lee, Y. F., et al. Una herramienta ultrasónica para el bloqueo de la conducción nerviosa en modelos de ratas diabéticas. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el uso de ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU) para bloquear los potenciales de acción desde el nervio ciático hasta el músculo gastrocnemio en un modelo de rata diabética. Al administrar el haz HIFU al nervio, una disminución en la señal muscular confirma el potencial de HIFU como una terapia no invasiva para el alivio del dolor neuropático diabético.

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Bloqueo de la conducción nerviosa in vivo con el transductor de ultrasonido focalizado de alta intensidad (HIFU)

NOTA: El experimento in vivo comienza en la semana 5 después de una inyección de estreptozotocina (STZ) de 50 mg / kg.

Realizar procedimientos en animales antes de bloquear los potenciales de acción muscular compuestos (CMAP) con sonicación HIFU.
1. Esterilice los instrumentos quirúrgicos (bisturí, tijeras, fórceps y gancho de vidrio) en un autoclave antes de la cirugía.
2. Anestesiar a las ratas con una inyección intraperitoneal de mezcla de tiletamina/zolazepam (40 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) o mediante la inhalación de isoflurano al 1,75% a través del vaporizador de isoflurano. Coloque a las ratas en una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal.
3. Coloque las ratas para la cirugía en decúbito ventral. Aplica la pomada para los ojos. Extienda la pata de la rata y pellizque la superficie plantar del pie con las uñas para determinar la profundidad de la anestesia. Si las ratas muestran respuestas de abstinencia, aplique anestesia adicional.
4. Retire el vello del muslo y la parte inferior de la espalda de las ratas con una maquinilla eléctrica. Aplique yodo líquido con una gasa limpia en el sitio quirúrgico y mueva circularmente la gasa hacia afuera del sitio quirúrgico. Use una almohadilla con alcohol para limpiar el yodo líquido con el mismo movimiento circular. Este experimento se realiza en los sitios quirúrgicos izquierdo y derecho. Repita el procedimiento en el otro sitio quirúrgico cuando realice el siguiente paso del procedimiento.
5. Use unas tijeras quirúrgicas estériles o un bisturí para hacer una incisión en la piel en la parte dorsal del muslo. Use tijeras quirúrgicas romas para separar cuidadosamente el tejido debajo de la piel y asegurar la piel con ganchos para la piel. El fémur se puede ver dentro de los músculos.
6. Use tijeras para separar cuidadosamente los músculos paralelos al fémur hasta que las fibras del nervio ciático de la mitad del muslo que están incrustadas en los músculos sean visibles. Use con cuidado un gancho de vidrio para separar el nervio ciático de la mitad del muslo de los tejidos conectivos y músculos circundantes.
Coloque el nervio ciático en la zona focal HIFU utilizando un fijador nervioso hecho a medida (Figura 1 y Figura 2).
NOTA: El fijador nervioso hecho a medida consta de 3 componentes (Figura 2). Todos los componentes están hechos de polimetilmetacrilato transparente (PMMA). La rosca externa de la estructura superior del componente I tiene una altura de 2,5 mm y M10XP0,7 (Figura 3A). El pozo central es un orificio de 4,0 mm de diámetro a través del componente I. La abertura inferior del pozo está sellada con una hoja de cinta adhesiva. El diámetro de la ranura es de 1,2 mm y la distancia entre el plano central de la ranura y la superficie superior del componente I es de 3,1 mm. El componente II consta de un cuerpo principal, cuatro patas y la estructura inferior (Figura 3B). La rosca interna de la estructura inferior tiene una altura de 2,5 mm y M10XP0.7 para adaptarse a la rosca externa del componente I. El diámetro del orificio central es el mismo que el del pozo central del componente I. Las dimensiones del cuerpo principal son de 32 mm de diámetro y 5,4 mm de grosor. Cuatro patas están desplegadas simétricamente. Dos patas cortas idénticas están diseñadas para la alineación, y dos patas largas idénticas funcionan para engancharse en el componente III. El diámetro exterior y la altura del componente III son de 41 mm y 9,2 mm. La rosca interna es M36XP1.0 y el orificio pasante tiene 27,5 mm de diámetro (Figura 3C). El cono es un cono hueco con una abertura superior de 84 mm de diámetro y una abertura inferior de 27,5 mm de diámetro. La altura es de 57,5 mm (Figura 4A).
1. Antes del experimento, sumerja el fijador nervioso acrílico hecho a medida en una solución de lejía durante 30 a 60 min, seguido de remojo en agua estéril.
2. Con un gancho de vidrio, levante el nervio con cuidado y colóquelo en la ranura del componente I.
3. Atornille el componente II al componente I. Llene el pocillo central del componente I con la solución de Ringer para la propagación ultrasónica y la preservación de los nervios.
4. Atornille el componente III al cono de la carcasa HIFU. Acople el componente III con el componente II a través de las cuatro patas del componente II.
  NOTA: El centro geométrico de los tres componentes y el transductor están alineados. La distancia entre el nervio y el transductor es igual a la distancia focal, lo que garantiza que el nervio esté dentro de la zona focal HIFU.
Inserte un par de agujas de acupuntura en el origen del nervio ciático y el otro par en el músculo gastrocnemio. Conecte cada par de agujas al sistema de adquisición de electrofisiología a través de un cable coaxial eléctrico (Figura 1).
NOTA: En un extremo del cable hay dos pinzas de cocodrilo para sujetar dos agujas por separado, y en el otro extremo del cable hay un conector Neill-Concelman (BNC) de bayoneta para conectar el sistema. Los pares de agujas de acupuntura funcionan como electrodos estimulantes en el nervio ciático y los electrodos de registro en el músculo gastrocnemio.
1. Establezca la velocidad de muestreo y el ancho de banda del sistema de adquisición de electrofisiología en 50 kHz y 70 Hz-3 kHz, respectivamente. Aplicar un estímulo supramáximo con un ancho de pulso de 0,1 ms a los electrodos estimulantes en el origen del nervio ciático.
2. Registre los CMAP de los electrodos de registro y amplifique los CMAP con el amplificador incorporado en el sistema de adquisición de electrofisiología.
  NOTA: Utilice el amplificador incorporado en el sistema de adquisición de electrofisiología para amplificar las señales nerviosas y registre los CMAP de los electrodos de registro con el sistema de adquisición de electrofisiología.
Utilice un transductor HIFU comercial de 2,68 MHz para suprimir los CMAP en ratas neuropáticas diabéticas.
NOTA: Las especificaciones del transductor se describen de la siguiente manera: un recipiente esférico de un solo elemento con un diámetro de apertura de 6 cm y una distancia focal de 5 cm, y una zona focal elipsoide de 4 mm de profundidad y 0,8 mm de ancho en el campo libre.
1. Sumerja el cono esférico, el transductor HIFU y la tapa del cono en el tanque lleno de agua desgasificada. Coloque el transductor HIFU en el cono esférico y fije la cubierta del cono a la abertura superior del cono esférico con seis tornillos de cabeza (Figura 4B). Después de que las burbujas en el cono esférico se expulsen naturalmente debido a la baja densidad de burbujas en comparación con el agua, selle la abertura frontal del cono con una cinta transparente de 0,03 mm de espesor. Atornille el componente III en el cono esférico.
2. Saque el transductor HIFU con el cono esférico y el componente III del tanque de agua desgasificada.
  NOTA: El agua de ósmosis inversa (RO) utilizada en el estudio es el agua purificada por el proceso de ósmosis inversa. El agua de ósmosis inversa se hierve para expulsar el gas. Después del enfriamiento, el agua desgasificada se obtiene en un tanque sellado individual.
Coloque el componente I en el espacio entre el nervio y el músculo con cuidado, y coloque el nervio en el espacio del componente I. Realice los pasos 1.2.3 y 1.2.4 para asegurarse de que el nervio esté dentro de la zona focal del HIFU (Figura 2A).
Vincule un generador de funciones y un amplificador de potencia de radiofrecuencia. Conecte el amplificador de potencia al transductor HIFU para generar el haz HIFU. Ajuste manualmente la salida de voltaje del generador de funciones al transductor HIFU a través del amplificador de potencia. Apague manualmente el generador de funciones una vez que se acabe el tiempo de exposición HIFU. Observe el tiempo usando un temporizador.
NOTA: La intensidad y la energía del haz HIFU utilizado en este estudio son 2.810 W/cm² y 84 J/mm², respectivamente.
Simultáneamente, administre el estímulo a través del sistema de adquisición de electrofisiología (paso 1.3) y el haz HIFU a través del sistema HIFU (paso 1.6) al nervio ciático mientras registra los CMAP. Aumente gradualmente la exposición al HIFU en el nervio ciático de 3 s, 5 s a 8 s hasta que se observe una disminución o inhibición de la amplitud de los CMAP.
1. Registra los CMAP una vez por segundo durante la entrega del haz HIFU. Después de observar el cambio en la amplitud de los CMAP, apague el sistema HIFU y haga clic manualmente en el icono de registro en el software de adquisición de electrofisiología para registrar los CMAP cada 2 minutos a principios de los primeros 10 minutos, cada 5 minutos en los 30 minutos consecutivos y cada 10 minutos en la última fase hasta que el tiempo de registro alcance las 2 h.
Separe los componentes II y III del fijador nervioso (Figura 2) para retirar el transductor HIFU del sitio de la incisión. Separe los componentes II e I para liberar el nervio ciático asegurado. Sutura el sitio quirúrgico de la rata diabética con 4-0 suturas de catgut crómico después de registrar los CMAP. Aplique yodo líquido en el sitio quirúrgico para prevenir infecciones.
1. Coloque las jaulas en la almohadilla térmica y permita que las ratas se recuperen en sus jaulas antes de devolverlas a la instalación de animales. Proporcione a las ratas ibuprofeno en agua potable durante 3 días o una inyección intraperitoneal de buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg).
Insertar electrodos estimulantes y de registro en el origen del nervio ciático y los músculos gastrocnemios de ratas neuropáticas diabéticas anestesiadas como se describe en los pasos 1.1.2 y 1.3 los días 7, 14 y 28 después de la sonicación inicial de HIFU.

Nombre	Empresa	Número de catálogo
Streptozotocin	Sigma	85882
Biopac MP36 sistema de adquisición	Biopac Systems, Inc.
Transductor HIFU	Sonic Concepts	H108
Generador de funciones	Agilent	33250A
Amplificador de potencia	Electrónica e Innovación	1040L
Ratas	Biolasco taiwan	Sprague-Dawley
Puralube Vaporizador	Dechra
Parkland	Scientific	V3000PS
Isoflurano	Attane

Ultrasonido enfocado de alta intensidad para bloquear los potenciales de acción nerviosa en un modelo de rata diabética

En este artículo

Resumen

Protocolo

Resultados

Materiales

Etiquetas