1. Preparación de gusanos para imágenes
- Preparación de las almohadillas de agar
- Hacer 3 ml de agar al 10% disolviendo agar de grado molecular en M9 en un tubo de cultivo de vidrio de 13 mm x 100 mm y microondas durante varios segundos.
NOTA. El agar fundido se puede mantener en un bloque de calor hasta por 1 h o se puede hacer fresco cada vez que se necesitan almohadillas de agar. - Coloque un portaobjetos de microscopio entre dos portaobjetos adicionales que tengan cada uno dos capas de cinta de laboratorio (véase la figura 1A-i).
- Corte la punta de una punta de pipeta de 1.000 μl (sin filtro) y utilícela para pipetear una pequeña gota de agar en el cubreobjetos central (Figura 1A-i).
- Aplana el agar presionando otro tobogán hacia abajo sobre el agar (Figura 1A-ii).
- Después de enfriar, corte el agar en un disco pequeño usando la abertura de un tubo de cultivo de vidrio de 13 mm x 100 mm (Figura 1A-iii) y luego retire el agar circundante.
- Preparación de la solución de liado de gusanos
- Disuelva el polvo de muscimol en M9 para crear un caldo de 30 mM. Separar en alícuotas de 50 μL y almacenar a 4 °C.
- Descongelar una nueva alícuota de 30 mM de muscimol cada 3-5 días (y almacenar a 20 °C mientras está en uso).
- Diluir un material de muscimol de 30 mM en una proporción de 1:1 con perlas de poliestireno para hacer la solución de laminación.
- Posicionamiento de un gusano para la obtención de imágenes
- Coloque 1,6 μl de la solución de laminación en el centro de la almohadilla de agar.
NOTA: La cantidad de líquido debe ajustarse para obtener imágenes de animales más jóvenes (menos) o más viejos (más). - Usando el pico de gusano preferido (es decir, un pico de vidrio o alambre de platino), transfiera un gusano de la edad deseada sin el fenotipo de múltiples vulvas a la solución rodante en la almohadilla de agar (Figura 1A-iv). nota. Los datos representativos son de hermafroditas de 1 día de edad (cepa GCaMP6f = FJH185; cepa mitoGCaMP; FJH597), que se puede identificar por la presencia de una sola fila de huevos.
- Espere ~ 5 min para que el muscimol reduzca el movimiento del gusano y luego deje caer un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm sobre la almohadilla de agar, restringiendo físicamente el movimiento del gusano.
- Para obtener imágenes de neuritas en el cordón nervioso ventral, enrolle el gusano en la orientación que se muestra en las Figuras 1B y 1C deslizando ligeramente el cubreobjetos.
NOTA. Para visualizar el cordón nervioso ventral, coloque el gusano con la cabeza hacia arriba y haga rodar el gusano hasta que el intestino esté en el lado derecho de la porción proximal y el izquierdo para la porción distal del gusano (desde la perspectiva del espectador). Invierta esta orientación (Figura 1C) para obtener imágenes de neuritas en el cordón nervioso dorsal.
- Montaje del gusano en un microscopio
- Coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos antes de montarlo en la platina del microscopio.
- Encuentre el gusano usando un objetivo de bajo aumento (10x) en campo claro.
- Cambie al objetivo de 100x y ajuste el enfoque.
- Localice la neurita AVA utilizando la iluminación del GCaMP o mitoGCaMP con el láser de imágenes de 488 nm.
NOTA: Utilice pequeños ajustes para evitar aplastar el gusano o arrancar el cubreobjetos.
2. Adquisición de flujos de imágenes de alta resolución
- In vivo GCaMP imaging
- Establezca el tiempo de exposición en 20 ms.
- Ajuste la configuración del láser de imágenes y la adquisición hasta que la fluorescencia basal GCaMP esté en el rango medio del rango dinámico de la cámara. Consulte la discusión para obtener sugerencias sobre la optimización de los parámetros de imágenes utilizando otras configuraciones de microscopía.
NOTA: Para la configuración óptica utilizada en este estudio, configure el láser de imágenes de 488 nm en las siguientes configuraciones de salida: potencia del láser = 50% y atenuación = 1. Modifique los ajustes de adquisición adicionales de la siguiente manera: Multiplicación de electrones EM) ganancia = 200 y ganancia del preamplificador = 1. - Después de localizar la neurita AVA utilizando la fluorescencia GCaMP con un aumento de 100x, ajuste el corrector de deriva Z (ZDC, consulte la tabla de materiales) en un rango de ±30 μm e inicie el enfoque automático continuo. Corrija manualmente el plano focal según sea necesario antes de obtener imágenes.
- Adquiera un flujo de imágenes con un aumento de 100x. Se pueden lograr duraciones de hasta 10 minutos con la configuración utilizada en este estudio.
- Imágenes in vivo mitoGCaMP
- Siga los pasos 2.1.1- 2.1.2 según sea necesario para adquirir la fluorescencia mitoGCaMP basal en el rango medio para el rango dinámico de la cámara.
NOTA. Para la configuración óptica utilizada en este estudio, configure el láser de imágenes de 488 nm en los siguientes ajustes de salida: potencia del láser = 20% y atenuación = 10. Modifique la configuración de adquisición de la siguiente manera: ganancia EM = 100 y ganancia del preamplificador = 2. - Después de que las mitocondrias en la neurita AVA se localicen utilizando la fluorescencia mitoGCaMP, configure el ZDC como se describe anteriormente en el paso 2.3.
- Adquiera un flujo de imágenes con un aumento de 100x.
