Trasplante de células precursoras de interneuronas en el cerebro de un cachorro de ratón

Resumen

Fuente: Quattrocolo, G., et al. Trasplante homocrónico de precursores de interneuronas en cerebros de ratón posnatales tempranos. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el trasplante de células precursoras de interneuronas en el cerebro de ratón neonatal utilizando un enfoque homotópico o heterotópico. El procedimiento consiste en asegurar un cachorro receptor anestesiado, identificar la región del cerebro objetivo e inyectar una suspensión de células precursoras derivadas de un cachorro donante en la misma etapa de desarrollo. Después de la inyección, el cachorro se transfiere a una almohadilla térmica para su recuperación, lo que permite una evaluación posterior de la supervivencia y maduración de las células del donante.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Extracción del cerebro de ratón P0-P2

1. Justo antes de comenzar el procedimiento, llene varias placas de Petri con líquido cefalorraquídeo artificial (sACSF) de sacarosa carbooxigenada y fría. También llene los tubos de recolección con ~25 ml de sACSF.
2. Envuelva un cachorro de día postnatal 0 a 2 (P0-P2) en un poco de parafilm o un guante y colóquelo bien cubierto bajo el hielo. Configure un temporizador durante 5 minutos y enciéndalo. Pasado ese tiempo, retira al cachorro y comprueba que no responde al pellizco de la pata trasera.
3. Decapita al cachorro y recoge la cabeza en una placa de Petri llena de sACSF. Corta la piel a lo largo de la línea media para exponer el cráneo.
4. Localice la abertura en el cráneo en el rombencéfalo / médula espinal e inserte un extremo de las pinzas a lo largo de la porción dorsal del cráneo. Agarre suavemente el cráneo en la línea media y "pele" las piezas lateralmente para exponer el cerebro, teniendo cuidado de no dañar el cerebro.
5. Al extirpar las porciones dorsal y lateral del cráneo, use las pinzas o la espátula para extraer suavemente el cerebro del cráneo colocándolo debajo de la superficie ventral del cerebro, tratando de no dañar ningún área. Coloque el cerebro en otra placa de Petri llena de sACSF carbooxigenado. nota: Presentamos dos estrategias diferentes para diseccionar el hipocampo, el cuerpo estriado y la corteza. La primera estrategia (pasos 2.1-2.10) es útil para cualquier línea de ratón, mientras que la segunda estrategia (pasos 3.1-3.7) necesitaría un ratón reportero fluorescente para separar limpiamente el cuerpo estriado del globo pálido y otras estructuras cerebrales. Si no se desea el cuerpo estriado, ignore las partes específicas del cuerpo estriado de las dos técnicas

2. Cosecha el cuerpo estriado, el hipocampo y la corteza, Técnica # 1

1. Coloque todo el cerebro en el molde de la matriz seccionada, con el lado ventral hacia arriba. Coloque 1 hoja de afeitar a través de la porción más anterior del cerebro (a través del tracto olfatorio anterior).
2. Inserte otra hoja de afeitar justo detrás de la primera para generar un corte de 0,5 mm y coloque una hoja de afeitar adicional posterior a esta.
3. Transfiera estas rodajas a una placa de Petri con sACSF carbooxigenado y coloque el resto del cerebro en un plato separado con sACSF. Transfiera los cortes estriatales a un endoscopio de disección para visualizar el cuerpo estriado. Estas rodajas deben contener grandes porciones del estriado anterior y carecer de hipocampo. Utilice un endoscopio de disección fluorescente con Nkx2.1-Cre^+/-; Ai9^+/- para diferenciar la señal tdTomato estriatal débil de la señal tdTomato fuerte del globo pálido.
4. Con o sin fluorescencia, pellizque el cuerpo estriado de ambos hemisferios en todas las secciones y transfiera los trozos estriatales a un tubo de 50 ml debidamente etiquetado con sACSF, guárdelo en hielo.
5. Hemiseccionar el cerebro a lo largo de la línea media con fórceps o una cuchilla de afeitar y colocar el hemisferio de modo que la superficie medial quede hacia arriba.
6. Extirpar el tejido cerebral ventral (tálamo, ganglios basales, etc.) pellizcando este tejido con fórceps. Cuando esté completo, el hipocampo (una estructura en forma de salchicha que abarca el eje anteroposterior a lo largo de la corteza dorsal) y el lado ventricular de la corteza deben ser claramente visibles.
7. Para extirpar el hipocampo, inserte las puntas de las pinzas frente al hipocampo anterior y separe suavemente el hipocampo de la corteza moviendo las pinzas hacia atrás y pellizcando a lo largo del borde cortical del hipocampo. Transfiera el hipocampo aislado a un tubo de 50 ml debidamente etiquetado con sACSF, guárdelo en hielo.
8. Para diseccionar la corteza, coloque la corteza hemiseccionada con el lado medial hacia abajo. Luego use las pinzas para pellizcar las porciones más dorsal, ventral, anterior y posterior de la corteza para dejar un trozo cuadrado de corteza somatosensorial medial, ~ 2 mm x 2 mm. Voltee la corteza para que el lado medial esté hacia arriba y limpio de cualquier exceso de tejido no cortical (tálamo, ganglios basales, etc.) en la superficie medial si es necesario. Transfiera el trozo de corteza a un tubo de 50 ml debidamente etiquetado con sACSF, guárdelo en hielo.
9. Repita el procedimiento con el otro hemisferio para recolectar las regiones del hipocampo y la corteza.
10. Repita este procedimiento para todos los cachorros, asegurándose de reemplazar el sACSF en las placas de Petri entre cachorros para asegurarse de que el sACSF permanezca frío y fresco.

3. Cosecha el cuerpo estriado, el hipocampo y la corteza, Técnica # 2

1. Coloque el cerebro con el lado ventral hacia abajo en una placa de Petri recubierta de sylgard que contenga sACSF y fíjela a través del cerebelo y la corteza anterior o los bulbos olfatorios.
2. Comenzando con un hemisferio, use fórceps curvos para separar suavemente la corteza posterior del hipocampo subyacente y otros tejidos. Coloque suavemente la corteza pelada sobre la placa de Petri. Repita para el otro hemisferio. El hipocampo y el cuerpo estriado deben ser claramente visibles en el cerebro expuesto.
3. Use fórceps para pellizcar un hipocampo en la línea media y pele el hipocampo lateralmente para quitarlo. Coloque en el frasco de recolección sobre hielo y repita con otro hipocampo.
4. Para el cuerpo estriado, raspe suavemente alrededor de los bordes del cuerpo estriado para aflojarlo del tejido circundante. Luego, retire el cuerpo estriado pellizcándolo desde abajo y agréguelo al tubo de recolección con hielo. Repita para el otro cuerpo estriado.
5. Las secciones corticales se pueden recolectar como se describe en el paso 2.8.
6. Si se utiliza una línea de ratón reportero transgénico (p. ej., Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, etc.), transfiera el cuerpo estriado a una placa de Petri con sACSF y vea bajo un endoscopio de disección fluorescente. Use fórceps para eliminar cualquier tejido no estriatal del cuerpo estriado (en Nkx2.1-Cre; Los ratones Ai9 eliminan todo el tejido "brillante", ya que el globo pálido tiene una eminencia ganglionar medial mucho mayor o una densidad de células tdTomato+ derivada de MGE en comparación con el cuerpo estriado). Repita para todo el cuerpo estriado.
7. Repita este procedimiento para todos los cachorros, asegurándose de reemplazar el sACSF en las placas de Petri entre cachorros para asegurarse de que el sACSF permanezca frío y fresco.

4. Generación de disociaciones unicelulares

1. Una vez completada la disección, prepare una solución de pronasa de 1 mg / ml pesando 10 mg de pronasa y disolviendo en 10 ml de sACSF carbooxigenado.
2. Transfiera el tejido de los viales de recolección de 50 ml a tubos de fondo redondo de 5 ml que contengan 2 ml de la solución de Pronase-sACSF. Incube el tejido durante 20 minutos a temperatura ambiente, agitando / moviendo el tubo 3-4 veces con el dedo durante la incubación para mezclar las muestras.
3. Durante esta incubación, prepare la solución de reconstitución: suero bovino fetal al 1% (FBS, 100 μL) + ADNasa (1 μL de ADN 1:10.000 stock) en 10 mL de sACSF carbooxigenado.
4. Después de los 20 minutos, retire con cuidado la solución de pronasa para no alterar el tejido en el fondo y reemplácela con 1-2 ml de la solución de reconstitución (el volumen total depende de la cantidad inicial de tejido).
5. Disociar mecánicamente el tejido triturando el tejido con las pipetas Pasteur pulidas al fuego previamente preparadas. Comenzando con la pipeta de gran calibre (~600 μm), aspire y expulse la solución de tejido al menos diez veces para romper el tejido. No introduzca burbujas en la solución. Repita este proceso para la pipeta de calibre medio y la pipeta de diámetro pequeño. La solución debe estar turbia y no debe verse ningún trozo de tejido transparente en los tubos de recolección.
6. Pipetear la solución de lisado celular a través de un filtro de 50 μm en tubos cónicos de 5 ml para eliminar cualquier grumo celular. Proceda con estas soluciones de células individuales a la citometría de flujo (o potencialmente directamente al recuento de células si no se necesita clasificación).

5. Preparación de soluciones celulares purificadas por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para trasplante

1. Una vez recibidas las soluciones celulares del citómetro de flujo, transfiera la solución a uno (o varios) tubos cónicos de 1,5 ml y centrifugue las células a 500 g durante 5 min a 4^oC. Después de la centrifugación, retire el medio para que ~ 20-40 μL permanezcan en el tubo. Reconstituya las células en este medio restante (y combine la solución si se necesitan varios tubos).
2. En un pequeño trozo de parafilm, mezcle 2 μL de solución celular + 8 μL de sACSF + 10 μL de tinción azul de tripano. Pipetear 10 μL en un hemocitómetro con tapa deslizante.
3. Cuente el número de células vivas en cada una de las cuadrículas cuadradas de 4 x 4 en las esquinas del hemocitómetro usando un contador de conteo manual de laboratorio estándar (las células muertas serán azules por el tinte) y promedie estos 4 recuentos. Multiplique este número por 100 para determinar el número de células por μL.
4. Si es necesario, ajuste el volumen para que las células estén a una concentración de 10,000-30,000 células / μL en la solución de reconstitución. La concentración final depende de la cantidad total de células y del número deseado de trasplantes. Mantener las células en hielo para el trasplante

6. Trasplante a cachorros P0-2 WT

1. Envuelva un cachorro de tipo salvaje (WT) en un poco de parafilm o un guante y colóquelo bien cubierto bajo el hielo. Pon un temporizador de 5 minutos y ponlo en marcha. Pasado ese tiempo, retira al cachorro y comprueba que no responde al pellizco de la pata trasera.
2. Mientras el cachorro está en hielo, mezcle la solución celular pipeteándola varias veces para asegurarse de que la suspensión celular esté bien mezclada antes de la carga (mezcle las células antes de cargar la micropipeta para cada inyección). Luego vacíe la micropipeta del aceite mineral y llénela completamente con la suspensión celular.
3. Coloque al cachorro anestesiado en la placa de Petri con la cabeza apoyada sobre la masilla adhesiva para que la parte superior de la cabeza quede relativamente plana. Coloque la cinta con el orificio de diamante a través de la cabeza del cachorro, tirando de ella para asegurarse de que la piel esté estirada y la cabeza esté firme, pero que el ratón esté cómodo y respire bien. Lambda debe ser visible a través del orificio de diamante.
4. Mueva el cachorro asegurado debajo del Nanoject y baje la micropipeta para que la punta de la micropipeta quede directamente encima de lambda. Registre las coordenadas x-y en el manipulador.
5. Ajuste las perillas del manipulador para mover la micropipeta a las coordenadas deseadas a lo largo del eje mediolateral y anteroposterior de la cabeza: corteza somatosensorial primaria o corteza S1 → 1,0 mm anterior y 1,0 mm lateral, hipocampo → 0,75-1,0 mm anterior y 1,0-1,2 mm lateral, estriado → 2,0-2,2 mm anterior y 1,5 mm lateral. Las coordenadas se pueden ajustar ligeramente para compensar la edad del cachorro (p. ej., P0 vs. P2) o la cepa de ratones (p. ej., los ratones CD1 son más grandes que y C57 / B6 en P2).
6. Baje la micropipeta hasta que forme una pequeña concavidad en la piel. Luego, gire la perilla del manipulador del eje z con firmeza pero suavemente para conducir la micropipeta a través de la piel y el cráneo para ingresar al cerebro. Cuando la micropipeta ingrese al cerebro, se liberará la presión sobre el cráneo y la concavidad desaparecerá.
7. Retraiga ligeramente la micropipeta hasta que la punta esté rodeada por un cono de piel, en forma de tienda de campaña. Lea las coordenadas a lo largo de los ejes z: Este será el punto cero del eje z.
8. Baje la micropipeta a la profundidad deseada: Corteza → 0,75-1,0 mm, Hipocampo → 1,2-1,5 mm, Estriado → 2,0-2,5 mm. La profundidad se puede ajustar ligeramente para compensar la edad o la tensión del cachorro.
9. Inyecte la suspensión celular utilizando el programa Nanoject III descrito anteriormente. Una vez completado el programa de inyección, espere de 15 a 20 segundos antes de retraer lentamente la micropipeta para minimizar la fuga de la solución fuera del lugar de la inyección.
10. Si realiza inyecciones bilaterales, vuelva a poner a cero la micropipeta por encima de lambda y muévase a las coordenadas adecuadas en el otro hemisferio. Alternativamente, se pueden hacer dos inyecciones en la corteza del mismo hemisferio moviendo la micropipeta 1 mm antes de la primera inyección.
11. Una vez que se complete el trasplante, retire la cinta y transfiera al cachorro a la almohadilla térmica. Si es necesario, etiquete al cachorro cortando la cola o el dedo del pie. Una vez que el cachorro haya recuperado un color rojo y se esté moviendo, colóquelo nuevamente en la jaula con la madre.

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