Transfección mediada por electroporación de ganglios de la raíz dorsal de ratón para promover la regeneración sensorial de axones

Resumen

Fuente: Li, Q. et al. Investigación de la regeneración de axones de mamíferos: electroporación in vivo del ganglio de la raíz dorsal de ratones adultos. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la transfección mediada por electroporación de neuronas DRG de ratón para estudiar la regeneración de axones. Describe los pasos para administrar construcciones de ácido nucleico a las neuronas DRG, inducir la lesión del nervio ciático y evaluar la regeneración axonal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Inyección del ganglio de la raíz dorsal (DRG)
   1. Inyecte una solución anestésica (diluya avertina en solución salina estéril a una concentración final de 20 mg/ml, con avertin 200 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal para mantener la anestesia antes de la inyección de DRG.
   2. Cargue los plásmidos de ácido desoxirribonucleico (ADN) u oligos de ácido ribonucleico (ARN) (1 μL por DRG) en la pipeta capilar de vidrio.
   3. Inserte la punta de la pipeta de vidrio capilar con cuidado en el DRG.
   4. Inyecte gradualmente una solución de 1,0 μl de plásmidos de ADN u oligos de ARN en el DRG utilizando los sistemas de dispensación de microinyección intracelular (30 psi, 8 ms).
      NOTA: La duración de la inyección no debe durar menos de 5 minutos.
2. Electroporation
   1. Gota de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en las puntas de los electrodos.
   2. Limpie el sangrado con una gasa de algodón cuadrada esterilizada.
   3. Pellizque suavemente el DRG objetivo con los electrodos y aplique 5 pulsos eléctricos cuadrados con el sistema de electroporación.
   4. Cierre las capas de músculo y piel con suturas de nailon 5-0, respectivamente.
   5. Coloque al ratón sobre una manta térmica (35,0 ° C) bajo mucha atención hasta que haya recuperado completamente la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Regrese el ratón a la jaula de casa después de que se haya recuperado por completo de la anestesia.
      NOTA: El ratón tarda aproximadamente 60 minutos en recuperarse completamente de la anestesia en la manta de 37 °C. Disuelva una pastilla (200 mg) de ibuprofeno en 1.000 ml de agua (0,2 mg/ml) para la alimentación diaria para aliviar el dolor posquirúrgico.
3. Aplastamiento del nervio ciático
   1. Dos o tres días (dependiendo del diseño experimental) después de la electroporación con DRG, anestesiar al ratón por vía intraperitoneal con la solución anestésica (con avertin 400 mg/kg de peso corporal).
   2. Pega con cinta adhesiva las cuatro extremidades del ratón en el tablero de corcho.
   3. Haga una incisión de 1 cm 0,5 cm hacia el lado izquierdo a lo largo de la línea media. Corta los músculos, como el músculo glúteo mayor y el músculo piriforme, longitudinalmente. Exponga el segmento del nervio ciático entre el foramen ciático mayor y la muesca ciática.
   4. Aplaste el nervio con fórceps de microcirugía durante 12 s y marque el sitio del aplastamiento con una sutura epineural de nailon 10-0. Haga un nudo en la membrana dural para marcar el sitio del aplastamiento.
   5. Cierre las capas musculares y de piel con sutura de nailon 5-0.
   6. Coloque al ratón sobre una manta térmica (35,0 ° C) con mucha atención hasta que haya recuperado completamente la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Regrese el ratón a la jaula de casa después de que se haya recuperado por completo de la anestesia.
      NOTA: El ratón tarda aproximadamente 60 minutos en recuperarse completamente de la anestesia en la manta de 37 °C. Disuelva una pastilla (200 mg) de ibuprofeno en 1.000 ml de agua (0,2 mg/ml) para la alimentación diaria para aliviar el dolor posquirúrgico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ECM 830 Sistema de electroporación de onda cuadrada	BTX Harvard Apparatus	45-0052	Para electroporación in vivo
Electrodos Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	Para electroporación in vivo, 1 mm plano
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Sistemas de dispensación de microinyección intracelular
Capilares de vidrio de borosilicato	World Precision Instruments, Inc.
Microscopio de disección estéreo	Leica	M80
Pinzas de microcirugía	FST por DUMONT, Suiza	11255-20	Solo para aplastamiento del nervio ciático
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, cinta de pared estándar
	Fisherbrand	15-901-30	Para fijar el ratón en el tablero de corcho
2, 2, 2-Tribromoetanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin solución madre
2-metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin solución madre
siRNA Fluorescente Universal Negativo Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	ARNip no objetivo con
microARN de fluorescencia Control de transfección mímica con Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	MicroARN no objetivo con
fluorescencia Kit de preparación de plásmidos	Invitrogen Purelink	K210016	Preparación de plásmidos codificantes de GFP
Colorante verde rápido	Millipore-Sigma	F7252	Para una mejor visualización del contorno del DRG durante la inyección
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Inducción de anestesia
Xilacina	AnaSed	NDC 59399-110-20	Inducción de anestesia
Acetaminofén	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Alivio del dolor posquirúrgico

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