Cuantificación de espinas dendríticas mediante imágenes de microscopía confocal

Resumen

Fuente: Gouder, et. al. Cuantificación tridimensional de espinas dendríticas a partir de neuronas piramidales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. J. Vis. Exp. (2015).

Este video demuestra la obtención de imágenes y el análisis de espinas dendríticas en neuronas piramidales transducidas e inmunomarcadas mediante microscopía confocal. Se reduce el ruido de fondo y se rastrean las dendritas estimando su diámetro y longitud. La segmentación automatizada de la columna vertebral implica establecer parámetros para las dimensiones de las dendritas y la columna vertebral y clasificar las espinas. Se genera y exporta un modelo 3D para su análisis.

Protocolo

1. Cultivo neuronal

1. Trate las placas de cultivo de 6 pocillos con cubreobjetos de vidrio con poliornitina (diluida a 1/6 en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, concentración de stock del 0,01%) durante la noche (O/N), seguido de tres lavados en DPBS. A continuación, añadir laminina (concentración de stock 1 mg/ml, diluida 500 veces en DPBS) durante al menos 10 horas bajo la campana de flujo.
2. Colocar en placa y enviar células madre neurales (NSC) a baja densidad (50.000 células/cm2) en placas de cultivo de 6 pocillos con cubreobjetos de vidrio en 3 ml de medio de cultivo que consisten en la mezcla de medio / nutriente Eagle modificado F-12 o DMEM / F12 (500 ml) de Dulbecco, 2 viales (5 ml cada uno) de suplemento de N2, 2 viales (10 ml cada uno) de suplemento de B27, 10 ml de Pen-Estreptomicina (Penicilina = 10.000 unidades/ml y Estreptomicina = 10.000 unidades/ml), 1 ml de 2-mercaptoetanol (Solución madre: 50 mM) y laminina (1/500), sin factores de crecimiento.
   PASO CRÍTICO: Realice este paso con cuidado añadiendo células con movimientos de rotación lenta para reducir la agrupación celular.
3. Retire el medio de cultivo. Agregue medio N2B27 fresco que contenga 2 μg / ml de solución de laminina fresca para mantener la neurona adherida a los cubreobjetos de vidrio y evitar grumos. Cambie el medio cada 3 días. Conservar parte del medio restante (200 μl) antes de añadir medio fresco para evitar que la célula se seque. Alternativamente, proceda rápidamente y cambie el volumen total (3 ml).

2. Transducción lentiviral

Nota: La expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) es impulsada por el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK) de ratón. Para este estudio, el título viral fue de 400 ng/μl (solución madre en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x).

1. Transducir células madre pluripotentes inducidas humanas o neuronas derivadas de iPSC en cualquier etapa de maduración por partículas virales agregando 1 μl de la solución madre que contiene 40 ng de vector lentiviral GFP por pocillo de cultivo (placas de 6 pocillos) e incubar durante 48 h en medio de cultivo fresco. Nota: Para este protocolo, la duración de la incubación permite un buen etiquetado de las estructuras de la columna vertebral.

3. Nota de inmunofluorescencia

: Con el fin de mejorar el etiquetado de la morfología de toda la columna vertebral, el marcado de inmunofluorescencia se realizó utilizando un anticuerpo anti-GFP en condiciones permeabilizadas.

1. Retire el medio de cultivo y fije las células transducidas en cubreobjetos en paraformaldehído al 4% durante 10 min a temperatura ambiente o RT, luego lave 3 veces en 1x PBS (10 min cada uno).
2. Sumerja los cubreobjetos en PBS suplementados con Tritón al 0,05% (100x) y suero de caballo al 10% durante 1 hora a temperatura ambiente, luego lávelos 3 veces en 1x PBS.
3. Agregue 100 μl de 1x PBS suplementado con 4% de suero de caballo y anticuerpo primario (1/1,000) elevado contra GFP y diluido por un factor de 1,000 en cada cubreobjetos. Incubar en una caja oscura O/N a 4 °C, luego lavar 3 veces con 1x PBS.
4. Diluir el anticuerpo conjugado Alexa Fluor 488 (1/200) en PBS suplementado con Tween 20 al 0,5% e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, lave 3 veces en 1x PBS y monte cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con un medio de montaje para microscopía de fluorescencia.

4. Imágenes de la columna dendrítica

1. Realice imágenes confocales a través de un microscopio de escaneo láser confocal.
2. Seleccione neuronas sanas con morfología piramidal y una arborización dendrítica completa, y cuantifique al menos 10 neuronas por condición a partir de experimentos separados. Cuantificar 60 - 100 μm por dendrita.
3. Adquiera imágenes utilizando un objetivo de aceite de 40X NA = 1.3 y una línea láser de 488 nm para la excitación de GFP, con una potencia máxima típica a nivel de muestra de alrededor de 20 μW. Establezca el tamaño de píxel alrededor de 80 nm para muestrear correctamente las espinas dendríticas.
   Nota: El análisis posterior requiere una imagen en la que el ruido no comprometa la segmentación adecuada de dendritas y espinas. Con el muestreo espacial y la configuración de potencia mencionados anteriormente, observamos que un tiempo de permanencia de píxeles de 3,15 μs es suficiente para recolectar suficientes fotones para construir dicha imagen. Para muestras tenues, la calidad de la imagen se puede mejorar promediando de 2 a 4 escaneos. Es posible que se necesite la adquisición de varios mosaicos XY para cubrir la región de interés, que luego deben unirse antes del procesamiento.
4. Para muestrear todo el volumen de neuronas, adquiera una pila Z con un espaciado Z que vaya de 150 nm a 300 nm, lo que produce de 20 a 30 cortes Z.
   Nota: La resolución espacial lateral lograda con esta configuración es de 234 nm y la resolución axial es de 591 nm. El muestreo elegido aquí es adecuado, pero como la resolución axial es mayor que el tamaño más pequeño de las espinas a fotografiar, el análisis favorece las espinas que se extienden lateralmente desde las dendritas.

5. 3D Cuantificación de espinas dendríticas

Nota: Las siguientes secciones describen específicamente el uso del software Imaris para el análisis. Existen implementaciones alternativas, como NeuronStudio o Metamorph, que pueden proporcionar resultados similares.

Utilice los siguientes ajustes clave:

1. Como etapa de preprocesamiento, el filtrado gaussiano se utiliza a través de las instalaciones de procesamiento de imágenes que ofrece el software. Realice el filtrado gaussiano a través del Procesamiento > suavizado de imágenes > Filtro gaussiano. Establezca el ancho del filtro para que sea igual al tamaño de píxel en XY.
2. Realice un trazado semiautomático de dendritas utilizando el módulo Filament Tracer del software.
   1. En primer lugar, calcule el diámetro de la dendrita utilizando la herramienta de distancia en la pestaña Slice del software.
   2. En la pestaña Superar, haga clic en la herramienta Filamentos. Para una mayor robustez, este protocolo se basa en un seguimiento semiautomatizado; haga clic en Omitir creación automática. La interfaz del módulo ahora muestra la pestaña Dibujar. Aquí, seleccione AutoPath como método, Dendrite como tipo e introduzca el diámetro estimado de la dendrita.
   3. Utilice el modo Seleccionar del puntero, convirtiendo el cursor en un cuadro. Pulse Mayús y haga clic con el botón derecho en el punto de inicio de la dendrita. Nota: El software realiza los cálculos iniciales.
   4. Mueva el puntero a lo largo del dendrita. Desde el punto de partida (representado como una esfera azul), se muestra una línea amarilla que representa la trayectoria de dendrita más probable. Mayús y haga clic con el botón izquierdo en el punto final de la dendrita.
3. Realice la segmentación automatizada de las espinas. Nota: Las espinas de la dendrita trazada se encuentran automáticamente mediante la interfaz del módulo.
   1. En la interfaz del módulo, haga clic en la pestaña Creación. En la lista desplegable Reconstruir, seleccione Reconstruir diámetro de dendrita y active la casilla Conservar datos. A continuación, haga clic en Reconstruir.
   2. Establezca el umbral para que el volumen segmentado corresponda al volumen real de la dendrita. Como algoritmo, seleccione la distancia más corta del mapa de distancia. Haga clic en el botón Siguiente.
   3. Determine el diámetro más pequeño de la cabeza del lomo y la longitud máxima, nuevamente usando la herramienta de distancia en la pestaña Slice del software, luego regrese a la pestaña Surpass e ingrese los parámetros. Para este protocolo, los valores alrededor de 200 - 300 nm para diámetro mínimo y 4 μm para longitud máxima son buenos puntos de partida. No marque la casilla Permitir espinas de rama. Haga clic en el botón Siguiente.
   4. Ajuste el umbral de puntos semilla para que los puntos azules que representan las espinas se localicen en cabezas de columna reales. Haga clic en el botón Siguiente. Nota: El cálculo del núcleo está hecho ahora y puede ser largo.
4. Clasifique los lomos yendo a la pestaña Herramientas de la interfaz del módulo. Haga clic en Clasificar espinas. En la interfaz de usuario solicitada, asegúrese de que haya cuatro clases, definidas por su morfología de la siguiente manera: Stubby: longitud <1 μm; Hongo: Largo (columna vertebral) >3 y Ancho máximo (cabeza) >ancho medio (cuello) x 2; Largo delgado: Ancho medio (cabeza) ≥ Ancho medio (cuello); Similar a filopodios: Longitud ≤ 4 μm (sin cabeza). Nota: La interfaz del módulo genera cuatro nuevos objetos de filamento que contienen los resultados de la clasificación.
5. Exportar datos estadísticos: en cualquiera de estas cuatro interfaces de objetos, vaya a la pestaña Estadísticas. Haga clic en el botón Exportar todas las estadísticas al archivo.
   Nota: Se pueden exportar otros valores estadísticos para dendritas (por ejemplo, longitud, área, diámetro medio, profundidad de rama, ángulo de ramificación, volumen, etc.) y espinas (p. ej., rectitud, área de unión, longitud y volumen de distintas partes de la columna vertebral, diámetro de la columna vertebral, densidades, etc.).

Materiales