Administración intratecal de virus en un modelo de ratón para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central

Resumen

Fuente: Li, D., et al. Inyección intratecal directa de virus adenoasociados recombinantes en ratones adultos. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra el procedimiento para la inyección intratecal de virus adenoasociados (AAV) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ratón despierto, que cubre la preparación de la jeringa, la alineación de la columna vertebral y la inserción precisa de la aguja. Este método valida la administración de genes dirigidos, lo que respalda su potencial para las terapias del SNC.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Preparación de la solución madre de clorhidrato de lidocaína al 20%

1. Pesar 2 g de clorhidrato de lidocaína. Agregue 5-6 ml de agua estéril y agite suavemente. Aumente el volumen a 10 ml con agua estéril.
2. 1.2 Filtrar la solución madre a través de filtros de 0,2 micras. Alícuota la solución madre, 1 ml por tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y séllala con una película de sellado. Conservar a 4 °C.

2. Entrega directa de AAV intratecal en ratones despiertos

1. Limpie el área de trabajo con una gasa estéril con etanol al 70% y prepare los suministros necesarios.
2. Preparar 100 μL de complejo de clorhidrato de lidocaína AAVrh.10/1% añadiendo 95 μL de solución madre de rAAVrh10 (5 x 10¹² copias del genoma/mL) en un tubo estéril de microcentrífuga de 200 μL, y añadir 5 μL de solución madre de clorhidrato de lidocaína al 20%. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, almacene la solución antiviral en hielo (4 °C).
   NOTA: Se utilizarán 8 μL por ratón.
3. Preparación de la jeringa con solución AAV para inyección
   1. Ensamble una jeringa Hamilton de 25 μL con una aguja de 27 G y alinee la punta biselada de la aguja con la escala volumétrica de la jeringa.
   2. Extraiga 8 μL con 4 x 10¹⁰ copias del genoma de la solución del virus en la jeringa suavemente. Asegúrese de eliminar las burbujas de aire.
4. Preparación del ratón
   NOTA: En este estudio se utilizaron ratones FVB/NJ machos o hembras (de 30 a 70 días de edad). La inyección de IT se realizó en el capó.
   1. Esterilizar el área de trabajo en una campana con etanol al 70%. Coloque el ratón despierto (macho o hembra, de 30 a 70 días de edad, 13 a 20 g de peso) sobre una pieza de cama en posición prona en la capucha. Cubra la parte superior del cuerpo con una gasa estéril para calmar al ratón y evitar que lo muerdan.
   2. Fije al animal agarrando adecuada y firmemente su cintura pélvica con el pulgar en un lado y el dedo índice/medio en el otro lado. Mantenga tensa la piel entre las cinturas pélvicas bilaterales con el pulgar y el índice. Sostenga suavemente la parte superior del cuerpo del animal con la palma de la mano.
   3. Afeite el pelaje de su espalda entre las cinturas pélvicas bilaterales, luego esterilice la superficie de la piel con un exfoliante a base de yoduro y etanol al 70%.
5. Inyección intratecal
   1. Sienta el espacio intervertebral a lo largo de la línea media entre las cinturas pélvicas bilaterales con el pulgar o el índice de la otra mano y presione una hendidura con una uña para indicar el espacio intervertebral L5-L6 (localice el lugar de la inyección).
   2. Gire la base de la cola ligera y suavemente para indicar la línea media de la columna vertebral. Ajuste el bisel de la aguja hacia la cabeza del animal antes de la inyección.
   3. Asegúrese de que los animales estén firmemente fijados y alinee la aguja a lo largo de la línea media de la columna vertebral.
   4. Inserte la aguja suave y verticalmente (o inclínela ligeramente 70-80 °) en la intersección de la hendidura, manteniendo la jeringa en un plano sagital central. Reduzca lentamente el ángulo a aproximadamente 30 ° cuando conecte el hueso, luego deslice la aguja en el espacio intervertebral.
      NOTA: Un evidente movimiento repentino de la cola es un signo de entrada exitosa en el espacio intradural. Una vez que la aguja ingresa al espacio intervertebral, la punta de la aguja se sentirá firmemente sujeta. La aguja de 27 G utilizada en este estudio es adecuada para la administración de TI en ratones, pero no en ratas.
   5. Inyecte la solución vectorial. Inicie el temporizador e inyecte 8 μL de la solución vectorial a una velocidad de 1 μL/4 s. Mantenga la aguja aproximadamente 1 minuto después de terminar la entrega. Retire la aguja con una rotación suave para evitar fugas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
FVB/NJ ratones	Charles River Laboratories China
Clorhidrato de lidocaína monohidrato	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core del Centro de Terapia Génica de la Universidad de Jeringa
de Medicina de Massachusetts de 25 μL / aguja de 27-30 g	GASTIGHT	1702
70% de etanol	WEN ZHI
Gasa	Wei AN	5171112	8 cm * 10 cm * 12 cm

Hamilton de la Escuela