Visualización del transporte intracelular de carga en astrocitos cultivados

Resumen

Fuente: Creighton, B. A., et al. Visualización y análisis del transporte intracelular de orgánulos y otras cargas en astrocitos. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la visualización del transporte de carga intracelular en astrocitos cultivados utilizando una sonda acidotrópica fluorescente que etiqueta selectivamente vesículas endolisosomales ácidas. Las imágenes de lapso de tiempo y la adquisición de pila Z con un microscopio confocal permiten el seguimiento de la carga marcada con fluorescencia en todo el volumen celular tridimensional. El análisis diferencia la carga estacionaria de la carga que se mueve hacia la periferia celular o el núcleo, proporcionando información sobre la dinámica del transporte intracelular.

Protocolo

1. Transfección de plásmidos marcados con fluorescencia

1. El día anterior a la transfección o etiquetado, siembra astrocitos a la densidad deseada para obtener imágenes 24-48 h después de la transfección. Una densidad recomendada para placas de 24 pocillos o pocillos de fondo de vidrio de 14 mm es de 2 x 104 células/pocillo.
   NOTA: Este protocolo está optimizado para la transfección de astrocitos sembrados en cubreobjetos de vidrio de 12 mm en placas de 24 pocillos o pocillos de fondo de vidrio de 14 mm utilizando un método basado en lipofección. Los reactivos deben escalarse según el tamaño de la placa de cultivo en la que crecen los astrocitos.
2. Diluir el reactivo de lipofección (Tabla de materiales) en medios de suero reducido (Tabla de materiales). Para optimizar la proporción de reactivo de lipofección a ADN, pruebe una variedad de diluciones adecuadas. Por ejemplo, si utiliza el reactivo empleado en este protocolo (Tabla de materiales), diluya 2, 3, 4 y 5 μL del reactivo de lipofección en 50 μL de medios de suero reducido.
3. Diluir 5 μg de ADN de alta pureza en 250 μL de medios de suero reducido. Añadir 5 μL de reactivo potenciador de la lipofección (Tabla de Materiales). Combine el tubo que contiene el reactivo de lipofección con un volumen igual de la mezcla de potenciador de lipofección de ADN. Mezclar mediante pipeteo e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
4. Retire los medios de cultivo de astrocitos y agregue la mezcla de transfección (paso 1.3) a las células gota a gota. Después de una incubación de 6 h a 37 °C y 5% de CO2, reemplace el complejo de transfección con un volumen adecuado de medios de cultivo de astrocitos (2 ml para placas con fondo de vidrio de 14 mm). Incubar durante 24-72 h adicionales antes de proceder a la adquisición de la imagen. Supervise de cerca la duración del paso de incubación para lograr el mejor equilibrio entre la expresión de proteínas y la viabilidad celular.

2. Etiquetado de endosomas / lisosomas tardíos mediante sondas fluorescentes

NOTA: Algunas cargas se pueden etiquetar con tintes fluorescentes con alta afinidad por proteínas específicas de carga. El siguiente ejemplo permite el etiquetado de endosomas tardíos/lisosomas con una sonda acidotrópica fluorescente.

1. Diluir la sonda de marcaje lisosomal (Tabla de materiales) en 200 μL de medios de cultivo de astrocitos a una concentración de trabajo de 1 μM y aplicar a los astrocitos del paso 1.1 a una densidad de 2 x 104 células/pocillo. Incubar durante 30 min a 37 °C.
2. Lave las células una vez con medios de cultivo de astrocitos tibios y reemplácelas con medios de imágenes (Tabla de materiales). Proceda a obtener imágenes en vivo de inmediato.

3. Adquisición de imágenes utilizando un sistema de imágenes de lapso de tiempo

NOTA: Las imágenes en vivo de lapso de tiempo deben realizarse utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad, enfoque definido, cámara de incubación y un objetivo de aceite de 40x con una alta apertura numérica (por ejemplo, Plan-Apochromat 1.4NA). Hay una variedad de software de adquisición disponible para imágenes de lapso de tiempo. La selección del sistema de microscopía y el software de adquisición debe basarse en su disponibilidad e idoneidad para los objetivos del estudio en particular. A continuación se proporcionan algunas pautas generales.

1. Coloque la cámara o placa de cultivo en el adaptador adecuado en la platina del microscopio. Usando luz de epifluorescencia, seleccione la(s) célula(s) que expresan(n) proteínas fluorescentes o la sonda para registrar. Ajuste la iluminación de la muestra fluorescente para visualizar las celdas seleccionadas utilizando la cámara digital. Evite el uso de alta iluminación que pueda causar fotoblanqueo y fototoxicidad. Ajuste el enfoque y el zoom.
2. Adquiera una sola serie de lapso de tiempo de pila Z a una frecuencia de 1 cuadro cada 2 s para intervalos de tiempo que oscilan entre 300 s y 500 s utilizando las funciones de zoom y enfoque definido.
   NOTA: La dinámica de tráfico (velocidad, frecuencia de movimiento, etc.) variará según la proteína de interés, por lo tanto, el curso de tiempo de adquisición puede requerir ajuste. Por ejemplo, las mitocondrias son menos móviles que los lisosomas y exhiben pausas frecuentes. En este caso, es más apropiado ajustar los parámetros de adquisición a 1 fotograma cada 5 s durante 800 s.
3. Guarde imágenes de lapso de tiempo y expórtelas como archivos de pila AVI o TIFF.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	FIJI inactivado por calor
(Fiji es solo imagen J)	NIH	Versión 1.52i
Pinzas de punta fina	F.S.T	11254-20	Estilo #5
Fuente de luz de fluorescencia	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
Platos de fondo de vidrio	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	Plato de 35 mm | No. 1.5 Cubreobjetos | Diámetro de vidrio de 14 mm | Pinzas
Graefe	F.S.T	11054-10	Pinzas Graefe Iris con puntas curvas
Colorante fluorescente verde que tiñe los compartimentos ácidos (endosomas tardíos y lisosomas)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Predisuelto en DMSOS a una solución madre de 1 mM. Diluir hasta la concentración final de trabajo en el medio de cultivo o tampón de su elección.
Solución salina equilibrada de Hank (10x)	Gibco	14065-056	Medios de imagen sin magnesio ni calcio
Microscopio	Life Technologies	A14291DJ	Solución de imágenes de células vivas
	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			Reactivo
potenciador de lipofección	Reactivo de	lipofección	11514015 Plus
Reactivo de lipofección	Life Technologies	15338100	Reactivo de lipofectamina LTX
Incubadora de agitación orbital	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230, incubadora de agitación orbital con control de temperatura y velocidad
Solución de penicilina/estrepomicina (100x)	Gen Clone	25-512
Solución salina tamponada con fosfato (10x)	Gen Clone	25-507x
Bromhidrato de poli-D-lisina Sigma		P7405	Disolver en tampón Tris, pH 8,5, a 1 mg/ml. Congele para almacenamiento a largo plazo. Evite los ciclos de congelación y descongelación
Medio sérico reducido	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Matraces de cultivo de tejidos	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. Acceso al cuello 100% en ángulo, tapa de filtro ventilada hidrofóbica de 0,22um
Incubadora de cultivo de tejidos	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, incubadora de cultivo de tejidos con control de
temperatura, humedad y CO2Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g disuelto en un litro en agua con 4.829 g de Tris HCl para hacer 0.1 M de tampón de Tris, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g disuelto en un litro en agua con 8.402 g de Tris Base para hacer 0.1 M de tampón de Tris, pH 8.5

sin recubrimiento confocal invertido https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox Life Technologies