El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

Resumen

En este protocolo, se describe la disección de placenta de ratón en el embarazo D10.5, seguido por el aislamiento de las células trofoblásticas utilizando un gradiente de Percoll. A continuación, demostrar el uso de las células aisladas en un ensayo de invasión de Matrigel.

Resumen

La placenta es responsable del transporte de nutrientes, gases y factores de crecimiento para el feto, así como la eliminación de los desechos. Por lo tanto, los defectos en el desarrollo placentario tienen importantes consecuencias para el feto y la madre, y son una causa principal de la letalidad embrionaria. El principal tipo de células de la parte fetal de la placenta es el trofoblasto. Las células primarias de ratón trofoblasto placentario son una herramienta útil para el estudio de desarrollo de la placenta normal y anormal, y a diferencia de las líneas celulares, se pueden aislar y utilizar para estudiar trofoblasto en etapas específicas del embarazo. Además, los cultivos primarios de trofoblasto de ratones transgénicos pueden ser utilizados para estudiar la función de genes particulares en células de la placenta. El protocolo presentado aquí se basa en la descripción por Thordarson et al. ^1, en ​​el que se utiliza un gradiente de Percoll para obtener una población de células relativamente puro trofoblasto de la placenta aislados de ratón. Es similar a utilizar el más ampliamentemétodos para ^2-3 d aislamiento humano trofoblasto celular. Pureza puede ser evaluada por tinción inmunocitoquímica de las células aisladas para la citoqueratina 7 ^4. Aquí, las células aisladas se analizan entonces usando un ensayo de invasión de Matrigel para evaluar la invasividad del trofoblasto in vitro ^5-6. Las células invadidas se analizaron mediante inmunocitoquímica y se tiñeron para el recuento.

Protocolo

1. La disección de la placenta del ratón

1. Configure parejas de apareamiento de ratones.
2. En cada uno de los días siguientes, para comprobar la presencia de un tapón copulatorio. El día en el que se detecta un enchufe se considera 0,5 días post-coito (dpc) ^7.
3. Placentas puede ser recogida en la etapa deseada del embarazo, con una disección limpia de la placenta principio posible con el desarrollo de la placenta madura en d 10,5. Aquí, demostramos 14,5 dpc. En los volúmenes dados, 40-60 placentas en 10,5 dpc, y 10-20 en placentas 14,5 dpc dará lugar a una capa de células del trofoblasto claramente visible.
4. Sacrificar al ratón embarazada, y extirpar el útero, el corte en el cuello uterino, ya lo largo de la mesometrium.
5. Con unas tijeras afiladas, corte entre cada embrión (Figura 1A).
6. Utilizando dos pares de pinzas, sujete la pared uterina en el borde cortado, y tire de ellos, la eliminación del miometrio (Figura 1B) . Un par de sierra, fórceps moderadamente finas (curvo o recto), más un par de pinzas muy finas (# 5, por ejemplo) se recomienda.
7. Frente a la placenta, abra la decidua con pinzas o tijeras, exponiendo placenta. Agarrando el tejido uterino con un par pinzas, fórceps deslizar otra debajo de la placenta se separe (Figura 1 C). Si el feto es necesario, independiente y membranas fetales de la placenta. No es posible eliminar todo el tejido decidual por disección sin perder también tejido de la placenta, pero el tejido decidual adicional (pálido) se puede quitar de la superficie de la placenta suavemente peeling con fórceps. Vamos a confiar en el gradiente de Percoll para una purificación adicional.
8. Coloque cada placenta disecado en 25 ml de hielo frío tampón de disociación en un tubo cónico de 50 ml hasta que todas las disecciones se han completado. En etapas posteriores, toscamente picada tejido de la placenta con unas tijeras o una cuchilla de afeitar antes de la transferencia en tampón de disociación.

tle "2>. Aislamiento de células trofoblásticas

1. Sin apretar la tapa cónica del tubo y colocarlo en un baño a 37 ° C durante 45-60 minutos. Mezclar la solución de disociación vigorosamente pipeteando aproximadamente cada 10 min. El tiempo total de digestión deben ser monitoreados de cerca y es probable que requiera un poco de ensayo y error para lograr una recuperación óptima de la célula. Los tejidos deben ser capaces de pasar a través de una pipeta de 10 ml, pero las piezas visibles del tejido se mantendrá. Overdigestion resultará en la supervivencia celular y la pobre eficiencia de plaqueo. La supervivencia celular óptima y eficiencia de plaqueo se producirá cuando grupos de unas pocas células están presentes, en lugar de cuando se completa disociación se logra. Por el contrario, underdigestion conducirá a la pureza reducido después de la separación de Percoll. Cuando el punto de digestión se ha alcanzado, tubo lugar en hielo para detener la actividad de colagenasa.
2. Pasar la solución a través de un filtro de células para eliminar los materiales no digeridos, y se centrifuga a 500 xg durante 5 minutos.
3. Para lavar, quitarsobrenadante y resuspender las células en 10 ml de solución de lavado. Centrifugar a 500 xg durante 5 minutos.
4. Durante la centrifugación, preparar la solución de Percoll por mezcla de 9,6 ml de Percoll, 13,4 ml solución de lavado y 1,1 ml de medio de 10 veces en un tubo de 199 ml 50 apropiado para centrifugación de alta velocidad.
5. Eliminar celular sobrenadante y resuspender el pellet en 2 ml de solución de lavado.
6. Añadir células a Percoll solución y centrifugar @ 30.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C.
7. Retire el tubo de centrífuga sin alterar el gradiente. Para visualizar el gradiente, tubo lugar delante de una fuente de luz brillante. Localizar la banda trofoblasto (Figura 2), y aspirar con una pipeta, teniendo cuidado de no alterar la banda de glóbulos rojos por debajo. Volumen de la banda trofoblasto será 5-8 ml.
8. Transferir las células trofoblásticas a un tubo cónico de 50 ml. Añadir la solución de lavado a un volumen total de 45 ml.
9. Centrifugar a 500 xg durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante y resuspender en la cultura medium (NCTC-135). Las células pueden ser cultivadas sobre Matrigel de capa fina o de plástico de cultivo de tejidos a 37 º C y 5% CO _2. En el día 10.5, cada placenta produce unas 50.000 células vivas, de las cuales el 80-90% son citoqueratina positiva.

3. Trofoblasto invasión de ensayo

1. Añadir 1-2 ml medio de cultivo (NCTC-135) a cada cámara de matrigel y se incuba a 37 °, 5% de CO ₂ durante 30-90 min.
2. Retire medio y añadir 1,5 ml x 10 ⁵ células recién aisladas en medio de 2 ml a la cámara superior. Añadir 1 ml de medio de la cámara baja para cubrir la superficie inferior de membrana.
3. Células Cultura inserta durante 18-24 horas.
4. Células raspar y matrigel de la inserción utilizando un hisopo de espuma.
5. Enjuague la parte superior e inferior de la cámara en 2 ml de PBS.
6. Arreglo para el 5 min en 1 ml de paraformaldehído al 4% en PBS.
7. Stain llenando la cámara inferior con 400 l de DAPI (300 nM) y se incuba durante 30 min.
8. Lavar tres veces brevemente en PBS.
10. Añadir una gota de 10 ul de medio de montaje (50% de glicerol en PBS) se deslice. Utilizando pinzas, coloque la membrana en la caída. Añadir otra caída de 10 l de medio, entonces el cubreobjetos con cuidado.
11. Fotografía y recuento de células. Asegúrese de orientar la membrana apropiadamente (celda hacia arriba o celda lateral abajo) para el microscopio que se utiliza. Image J software (Institutos Nacionales de Salud) incluye una característica de recuento manual que se puede utilizar para este propósito, al igual que Adobe Photoshop o un contador manual.

4. Los resultados representativos

Figura 1. Disección de la placenta del ratón. (A) El útero se elimina por corte a lo largo de los oviductos (amarillo), a lo largo de la superficie mesometrial, y el cuello uterino (la parte inferior). Conceptuses individuales pueden ser separados cortando con tijeras, como se muestra. (B) La uterino pared se elimina mediante la colocación de dos fórceps en la superficie uterina corte, y rasgando a lo largo del lado anti-mesometrial, cerca del feto y lejos de la placenta. (C) La placenta se aísla luego sujetando con una pinza deslizante y otro entre la placenta y el tejido uterino. El cordón umbilical y otras membranas extraembrionarias entonces se puede separar de la placenta.

Figura 2. Percoll separación de las células trofoblásticas. Después de la centrifugación, tres bandas principales será visible como se muestra en la historieta de la izquierda, y una fotografía de la derecha. La banda superior contiene restos celulares y fibroblastos y será más evidente. Un apretado (rojo) banda cerca de la parte inferior que contiene las células rojas de la sangre será visible justo debajo de la banda de trofoblasto difusa. Agregados celulares es probable que se ve en la banda trofoblasto, como en los dos se muestra justo a la izquierda de la flecha en la fotografía.

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Figura 3. Células invasoras trofoblasto (flecha blanca) pasará a través de la capa de matrigel y los poros de la membrana, aparece en la superficie inferior de la membrana. Los poros son también visibles (negro punta de flecha). El número de células sobre la superficie de la membrana entera o un área de muestra representativa puede ser contada. Una imagen en escala de grises de fluorescencia DAPI nuclear se ha invertido para mejorar la visualización de las células.

Células Figura 4. Trofoblasto puede ser identificada, y la pureza de la población aislada evaluados, por inmunotinción para citoqueratina 7 (centro, magenta). Las células se tiñen con DAPI (arriba, azul). Imagen fusionada inferior.

Discusión

En este video se demuestra el aislamiento de las células trofoblásticas de la placenta del ratón. Luego mostramos un ensayo in vitro para la invasión del trofoblasto. Usando este procedimiento, una gran parte, pero no totalmente, la población pura de células trofoblásticas se puede conseguir. Si se requiere mayor pureza, separación magnética perla o citometría de flujo se pudo realizar, como se ha descrito para las células trofoblásticas humanas primarias. La longitud adecuada de la etapa de colagenasa disociación debe ...