Imágenes confocales tridimensionales de alta resolución de la barrera hematoencefálica en una sección de cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Villaseñor, R y Collin. L. Imágenes confocales de alta resolución de la barrera hematoencefálica: imágenes, reconstrucción 3D y cuantificación de la transcitosis. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra imágenes 3D de alta resolución de la barrera hematoencefálica (BBB) utilizando microscopía confocal, mostrando secciones de cerebro de ratón teñidas con anticuerpos para analizar los componentes de BBB y las estructuras intracelulares, aplicables para estudiar la homeostasis cerebral, las interacciones neurovasculares y la disfunción de BBB relacionada con la enfermedad.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal correspondiente.

1. Imágenes confocales de alta resolución de la barrera hematoencefálica
2. Realice la adquisición de imágenes con un microscopio confocal de barrido láser adecuado (consulte la Tabla de materiales) con líneas láser a 405, 488, 561 y 633 nm para la excitación de fluoróforos en las regiones azul, verde, naranja y roja del espectro de luz. Para la adquisición de imágenes, utilice un objetivo de aceite de 63X con una apertura numérica de 1,4.
3. En el menú de adquisición del software que controla el microscopio, configure los parámetros de adquisición de imágenes. En el menú desplegable de 'Tamaño de imagen', seleccione un valor de 1024 x 1024 píxeles. Modifique el tamaño de píxel a un valor entre 200 y 300 nm ajustando el valor del menú 'Zoom'."
   NOTA: Para el análisis de estructuras intracelulares, reduzca el tamaño de píxel a 75 nm. Esta configuración de tamaño de imagen aumenta sustancialmente el tiempo de adquisición y se puede reducir a 512 x 512 píxeles para disminuir el tiempo de adquisición al obtener imágenes de un campo de visión más pequeño.
4. En el menú desplegable 'Velocidad de adquisición', seleccione un valor de 400 Hz, es decir, 400 líneas por segundo. En el menú 'configuración del sistema', seleccione el menú desplegable 'Profundidad de píxeles' y cambie el valor a 12 bits.
5. En el software del microscopio, dentro de la pestaña 'adquisición', active la opción de adquisición secuencial de marcos. Establezca el grosor de la sección óptica en un valor entre 0,75 y 1 μm para cada canal modificando el valor en el menú 'Pinhole'.
6. En el panel de excitación fluorescente, active el láser necesario para excitar de forma óptima los fluoróforos de la muestra, por ejemplo, una línea láser de 488 nm para un fluoróforo emisor de verde.
   NOTA: Utilice un visor de espectros de fluoróforos (consulte la tabla de materiales) para seleccionar el láser de excitación adecuado.
7. En el panel de detección de fluorescentes, mueva el control deslizante para seleccionar las longitudes de onda que se medirán en cada canal, por ejemplo, entre 510 y 550 nm para un fluoróforo emisor de verde.
   NOTA: Utilice un visor de espectros de fluoróforos (consulte la Tabla de materiales) para seleccionar las longitudes de onda de detección adecuadas.
8. Agregue una gota de aceite de inmersión con un índice de refracción de 1.52 en la parte superior del cubreobjetos con la sección del cerebro para que coincida con el índice de refracción del cubreobjetos de vidrio y el objetivo. Coloque la muestra en el microscopio y encienda la lámpara epifluorescente para visualizar la muestra con los binoculares del microscopio.
9. Con los botones del soporte del microscopio, cambie la rueda de filtros para seleccionar un filtro apropiado para visualizar núcleos teñidos con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol). Utilice el enfoque grueso para enfocar la señal de los núcleos teñidos con DAPI.
10. Con los botones del soporte del microscopio, cambie los filtros para visualizar la señal de los marcadores vasculares (por ejemplo, CollagenIV o CD31) y centre el campo de visión en un segmento capilar individual.
11. Presione el botón para iniciar el modo de escaneo en vivo. Durante el escaneo, ajuste la ganancia y la intensidad del láser para cada canal para maximizar el rango dinámico de las imágenes y evitar la saturación de píxeles.
    NOTA: Utilice una tabla de consulta que etiquete los píxeles saturados para evaluar visualmente la sobresaturación. Para evitar la sobresaturación de la señal, ajuste la configuración con la muestra que se espera que tenga la señal fluorescente más alta.
12. Establezca el valor para el promedio de línea en 2.
    NOTA: Cuando utilice velocidades de adquisición más altas, aumente este valor para reducir el ruido.
13. Establezca secciones de inicio y final para realizar pilas en z ópticas que abarquen todo el volumen del capilar. Utilice un tamaño de paso de 0,45 μm.
    NOTA: Si se van a utilizar imágenes para la cuantificación posterior, mantenga la misma configuración de adquisición para el conjunto de datos completo.
14. Para la cuantificación, adquiera de 10 a 20 pilas z por sección de al menos tres ratones diferentes para comparaciones estadísticas.
    NOTA: Adquiera el conjunto completo de datos en la misma sesión para reducir la variabilidad derivada del blanqueo de muestras y las fluctuaciones de intensidad del láser.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Clon de anticuerpo monoclonal de rata ER-MP12 contra CD31/PECAM	Novus Biologicals	MCA2388	Labels Brain Endotelials CellsUso en la dilución 1:100detectar con IgG policlonal anti-rata de burro (H+L) junto con colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en la dilución 1:400
Anticuerpo monoclonal de rata contra Podocalyxin	Sistemas de investigación y desarrollo	MAB1556	Etiquetas Lumen de los capilares Uso en la dilución 1:100 Detectar con IgG policlonal anti-rata de burro (H + L) acoplado con colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en la dilución 1:400
Anticuerpo policlonal de conejo contra ColágenoIV	Biotrend	BT21-5014-70	Etiquetas Membrana basal de los capilaresUso en la dilución 1:100detectar con IgG policlonal anti-conejo de burro (H+L) acoplado con colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en la dilución 1:400
Anticuerpo policlonal de cabra contra CD13	Sistemas de investigación y desarrollo	AF2335	Etiquetas pericitosUso en la dilución 1:100detectar con IgG anti-cabra policlonal de burro (H+L) acoplado con colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en la dilución 1:400
Clon de anticuerpo monoclonal de ratón G-A-5 contra GFAP acoplado a Cy3	Abcam	ab49874	Etiquetas AstrocitosUso en la dilución 1:100
Anticuerpo policlonal de conejo contra Iba-1	Wako	019-19741	Etiquetas MicrogliaUso en la dilución 1:100detectar con IgG policlonal anti-rata de burro (H + L) acoplado con colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en la dilución 1:400
Anticuerpo monoclonal de rata ABL93 gainst LAMP2	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	Etiquetas Lisosomas Uso en dilución 1:100detectar con IgG policlonal de burro anti-rata (H + L) junto con colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en dilución 1:400
Anticuerpo policlonal de burro contra IgG de ratón (H + L) AlexaFluor594	LifeTechnologies	A21203	Uso en dilución 1:400
Anticuerpo policlonal de burro contra IgG de ratón (H + L) AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	Uso en dilución 1:400
Anticuerpo policlonal de cabra contra IgG de ratón (H+L) AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	Uso en dilución 1:400
Medio de montaje fluorescente	Dako	S3023	Medio de montaje fluorescente Dako
Microscopio confocal de barrido láser	Leica Microsystems	NA	Leica TCS SP8 X con detectores HyD y láser de luz blanca
Software de procesamiento de imágenes	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF versión 3.1.0 compilación 8587
Software de análisis de imágenes	Bitplane software científico	NA	Imaris versión 7.6.5 compilación 31770 para x64
Fluorescence SpectraViewer	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html