Inyección subretiniana de vectores virales en el epitelio pigmentario de la retina en un modelo de ratón

En este artículo

Resumen

Fuente: Park, S. W., et al. Abordaje limbal-inyección subretiniana de vectores virales para terapia génica en el epitelio pigmentario de la retina de ratones. J. Vis. Exp. (2015)

El video describe el método para la inyección subretiniana de vectores virales en el epitelio pigmentario de la retina (EPR) en un modelo de ratón. Detalla el procedimiento desde la anestesia y la preparación ocular hasta la administración precisa del vector lentiviral, asegurando la integración y expresión génica en el EPR.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Preparación del kit de inyección y vectores virales

Prepare la jeringa de microlitros equipada con una aguja roma de 33 G esterilizada con gas de óxido de etileno. Diluir los vectores virales en PBS (solución salina tamponada con fosfato) para obtener un título adecuado en el microtubo (es decir, 1 x 10⁶ TU / μl). Enjuague la jeringa varias veces con vectores virales para eliminar cualquier espacio muerto en la jeringa.

2. Inyección subretiniana de vectores virales

Anestesiar a los ratones adultos (es decir, de 6 a 8 semanas de edad) con una inyección intraperitoneal de la mezcla de tiletamina y zolazepam (1:1, 2,25 mg/kg de peso corporal) y clorhidrato de xilacina (0,7 mg/kg de peso corporal) o un régimen de anestesia alternativo adecuado.
Dilatar las pupilas con un colirio de fenilefrina al 0,5% y tropicamida al 0,5%.
Prepare la jeringa de microlitros cargándola con 1,5 - 2 μl de vectores virales.
Abra el párpado y extruya el ojo para exponer el ecuador para una inyección conveniente. Concéntrese en él bajo el microscopio quirúrgico. Mantenga la posición del ojo protuberante hasta que termine la inyección, o puede ocurrir un desplazamiento de la aguja durante la inyección. Para sujetar el globo ocular con firmeza, coloque los dedos fuera del borde orbital.
Aplicar una gota de solución viscoelástica oftálmica sobre la superficie corneal.
Coloque un pequeño portaobjetos redondo en la parte superior de la córnea para visualizar la retina.
Perfore un pequeño orificio en la parte posterior leve del limbo con una aguja estéril de 30 G 1/2 para una inyección subretiniana adicional. Para mayor comodidad, haga que el orificio sea inferior para el ojo derecho y superior para el ojo izquierdo.
NOTA: Si el orificio se hace en el temporal o nasal, es difícil que el párpado lo cubra después de la inyección. La punción inicial debe hacerse ligeramente posterior al limbo para evitar los vasos limbales que corren a lo largo del limbo y se pueden reconocer fácilmente. Tenga cuidado de evitar golpear la lente con una aguja mientras realiza la punción inicial. No inserte todo el bisel de la aguja para evitar la perforación de la lente.
Coloque la aguja roma de 33 G de la jeringa de microlitros a través del orificio prepuncionado y acerque la aguja al espacio subretiniano hasta que sienta una leve resistencia.
NOTA: Para la inyección subretiniana, el mejor ángulo de aproximación de la aguja es de unos 45 grados contra el plano del iris, y la aguja roma debe empujarse posteriormente hacia el área peripapilar. El cuadrado punteado indica la vía de la aguja sugerida a través de la cavidad vítrea para la inyección subretiniana en la Figura 1.
NOTA: No se sentirá resistencia al perforar (o pasar) las capas de la retina, ya que son muy suaves. Por lo tanto, la primera sensación de resistencia leve indica que la aguja ya ha tocado la capa de EPR (epitelio pigmentario de la retina) y se debe detener la inserción de la aguja. Tenga cuidado de no penetrar el tejido escleral con una presión excesiva porque la aguja debe colocarse en el espacio subretiniano potencial. Si la aguja perfora el tejido escleral con una potencia excesiva, entra en los espacios orbitarios extraoculares sin resistencia. (Este paso es crítico)
Inyecte los vectores virales (p. ej., 1 x 10⁶TU / μl) suavemente en el espacio subretiniano sin temblor para evitar daños tisulares no deseados. Luego, retire la aguja suavemente. Sostenga el globo ocular firmemente durante la inyección, como se describe en 2.4.
Observe la formación de ampollas subretinianas después de la inyección bajo un microscopio quirúrgico para asegurarse de que no haya sangrado retiniano.

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Resultados

Figura 1. Diagrama esquemático de la inyección subretiniana. Sección transversal teñida con H&E (tinción con hematoxilina y eosina) del ojo del ratón que representa las estructuras con una vía de aguja para la inyección subretiniana marc...