$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Celdas de carga con perclorato de éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE)
NOTA: En este protocolo, TMRE se utiliza en modo sin enfriamiento a una concentración final de 20 nM. En general, se debe utilizar la concentración más baja posible de TMRE que aún proporcione suficiente intensidad de señal en el microscopio de elección. Debido a la evaporación desigual, el volumen de medio en diferentes pozos puede diferir en cultivos primarios a largo plazo. Para garantizar una concentración constante de TMRE en todos los pocillos, no agregue TMRE directamente a los pocillos. En su lugar, reemplace el medio en cada pocillo con la misma cantidad de medio que contenga TMRE. El siguiente protocolo está diseñado para neuronas primarias en placas de 24 pocillos que contienen ~1 ml de medio por pocillo.
- Trabajando en una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos, recoja 500 μL de medio de cada pocillo en un solo tubo cónico.
- Por pocillo, agregue 0,5 μL de material TMRE de 20 μM en el tubo cónico (por ejemplo, 12 μL para 24 pocillos).
- Aspire con cuidado el medio restante del primer pocillo y reemplácelo con 500 μL de medio que contenga TMRE. Continuar, pozo a pozo, con los pocillos restantes.
NOTA: Tenga cuidado de no dejar que las células se sequen y de no perturbar las células. - Regrese las células a la incubadora y espere al menos 60 minutos para que el tinte se equilibre.
NOTA: El tiempo de carga se puede extender a varias horas sin efectos adversos. - Para garantizar una concentración y un equilibrio constantes de TMRE durante todo el experimento de imágenes, asegúrese de incluir una concentración final de 20 nM TMRE en el tampón de imágenes y en todas las soluciones de estimulación.
2. Optimización de la configuración del microscopio confocal de barrido
NOTA: Este paso tiene como objetivo encontrar el mejor compromiso entre la calidad de la imagen y la viabilidad celular durante la obtención de imágenes en vivo. En esta sección se describe la optimización de la configuración para la obtención de imágenes de proteínas fluorescentes verdes sensibles a la oxidación por reducción (roGFP). Si se realizan imágenes multiparamétricas, se debe realizar una optimización similar, incluida la verificación de una línea de base estable sin signos de blanqueamiento o fototoxicidad, para los indicadores adicionales.
- Inicie el microscopio confocal y cargue los ajustes estándar para la obtención de imágenes GFP (excitación de 488 nm, emisión de 505 a 550 nm).
- Configure el detector en 12 bits o 16 bits. nota: Por lo general, 8 bits no son suficientes para imágenes cuantitativas.
- Active el modo de escaneo secuencial y agregue una segunda secuencia/pista (excitación de 405 nm, emisión de 505 a 550 nm).
- Para ambos canales, seleccione una tabla de búsqueda de pseudocolor que indique píxeles sobreexpuestos y subexpuestos (por ejemplo, GLOW OU).
- Seleccione un objetivo que sea adecuado para el objeto de interés.
NOTA: 10x-40x son adecuados para el análisis unicelular, 63x-100x son adecuados para el análisis de una sola mitocondria. - Monte un cubreobjetos con células en la cámara de imágenes, agregue 1 ml de tampón de imágenes y coloque la cámara en el microscopio.
- Utilice el ocular y la luz transmitida para enfocar las células.
NOTA: No utilice luz de epifluorescencia para localizar y enfocar las células. Incluso a baja potencia, esto afectará negativamente a las células. - Graba imágenes con diferentes formatos de píxeles. Con base en estas imágenes, seleccione el número de píxeles más bajo que proporcione una resolución aceptable de la estructura de interés.
NOTA: Por lo general, los píxeles de 512 x 512 funcionan bien para imágenes unicelulares con objetivos de 20x y 40x, y los píxeles de 1024 x 1024 o 2048 x2048 generalmente funcionan bien para imágenes de una sola mitocondria con un objetivo de 63x. - Graba imágenes con diferentes tamaños de estenopeicos. Con base en estas imágenes, seleccione el tamaño estenopeico más grande que brinde una resolución aceptable de la estructura de interés.
NOTA: Por lo general, 3-7 unidades aireadas funcionan bien. - Graba imágenes con diferentes intensidades de láser.
- Ajuste la ganancia y el umbral del detector en consecuencia. Con base en estas imágenes, seleccione la intensidad láser más baja que proporcione una intensidad de señal aceptable y una relación señal-fondo.
- Para determinar la relación señal-fondo, mida la intensidad de la señal en una región de interés (ROI) que contiene células o mitocondrias (ROI1) y en una ROI sin células ni mitocondrias (ROI2). Luego, divida la intensidad de ROI1 por la intensidad de ROI2.
>NOTA: Apunte a una relación señal-fondo de >3 e intensidades de señal de ROI individuales de 200-1,000 para excitación de 405 nm con 1-3% de potencia láser e intensidades de ROI individuales de 300-1,500 para excitación de 488 nm con 1% de potencia láser.
- Grabe imágenes con diferentes velocidades de escaneo y número de promedios de fotogramas. Grabe 4-5 imágenes para cada combinación de configuraciones. Basándose en estas series de imágenes, seleccione la velocidad más alta y la configuración promedio más baja que proporcionen un ruido de imagen aceptable y una variabilidad de imagen a imagen.
NOTA: Una velocidad de escaneo de 600 Hz y 1-2 fotogramas para promediar funcionan bien en la mayoría de los casos. - Con un nuevo cubreobjetos, grabe una serie de lapso de tiempo con los ajustes optimizados.
NOTA: La duración y el intervalo de imagen de la serie deben parecerse a los de los experimentos planificados. - Al final de la serie de lapso de tiempo, agregue 1 ml de solución de diamida (DA) 2x a la cámara de grabación. Imagen durante 2 min adicionales.
- Aspire el tampón de imágenes con una bomba peristáltica o una pipeta manual. Agregue 1 ml de 1x solución de ditiotreitol (DTT). Imagen durante 5 min adicionales.
- Analice el experimento de lapso de tiempo.
- Verifique que ninguno de los dos canales se sobreexponga o subexponga durante el tratamiento DA y DTT con la configuración optimizada.
- Asegúrese de que ninguno de los dos canales muestre un blanqueo considerable durante la grabación de lapso de tiempo; apunte a una pérdida de intensidad del <2% entre la primera y la última imagen.
- Verifique que la relación 405:488 no cambie considerablemente durante la obtención de imágenes.
- Repita todo el procedimiento de forma iterativa, utilizando varios cubreobjetos, hasta que se hayan definido los ajustes que proporcionan resultados aceptables de forma coherente.
3. Evaluación del estado redox basal
- Inicie el microscopio y cargue los ajustes optimizados de la sección 2.
- Establezca el promedio de fotogramas en 3-5.
- Monte un cubreobjetos con células en la cámara de imágenes, agregue 1 ml de tampón de imágenes y coloque la cámara en el microscopio.
- Utilice el ocular y la luz transmitida para enfocar las células.
NOTA: No utilice luz de epifluorescencia para localizar y enfocar las células. Incluso a baja potencia, esto afectará negativamente a las células. - Cambie al modo de escaneo y use el canal de 488 nm en la vista en vivo para enfocar y ubicar las células para obtener imágenes.
- Utilice la función multipunto para seleccionar de 3 a 5 campos de visión en el cubreobjetos.
- Grabar una imagen de referencia.
- Agregue 1 ml de 2x solución de DA a la cámara.
- Después de 1, 2 y 3 minutos, use la vista en vivo para confirmar/ajustar el enfoque y luego grabe una imagen.
NOTA: Las células generalmente se oxidan por completo después de 2 minutos. - Reemplace el tampón en la cámara de imágenes con 1 ml de 1x solución de DTT.
- Después de 3 y 5 minutos, use la vista en vivo para confirmar/ajustar el enfoque y luego grabe una imagen.
NOTA: Las celdas generalmente se reducen por completo después de 4-5 minutos.
4. Imágenes en vivo de tratamientos agudos
NOTA: El siguiente protocolo describe imágenes de la respuesta redox mitocondrial al tratamiento NMDA. Es posible que sea necesario ajustar los intervalos de imagen y la duración del experimento para otros tratamientos.
- Inicie el microscopio y cargue los ajustes optimizados de la sección 3.
- Establezca el intervalo de lapso de tiempo en 30 s y la duración en 25 min.
- Monte un cubreobjetos con células en la cámara de imágenes, agregue 1 ml de tampón de imágenes y coloque la cámara en el microscopio.
NOTA: Para evitar la deriva del enfoque térmico, deje las células en la platina del microscopio durante 10-15 minutos antes de comenzar las imágenes de lapso de tiempo. - Utilice el ocular y la luz transmitida para enfocar las células.
NOTA: No utilice luz de epifluorescencia para localizar y enfocar las células. Incluso a baja potencia, esto afectará negativamente a las células. - Cambie al modo de escaneo y use el canal de 488 nm en la vista en vivo para enfocar y localizar células para obtener imágenes.
- Opcional: Para aumentar el número de celdas registradas por ejecución, utilice la función multipunto para crear imágenes de 2-3 campos de visión por cubreobjetos.
- Inicie la adquisición de lapso de tiempo y grabe 5 imágenes como grabación de referencia de 2 minutos.
- Agregue 500 μL de solución NMDA 3x a la cámara (concentración final 30 μM) y grabe 20 imágenes adicionales como una respuesta NMDA de 10 minutos.
NOTA: Las neuronas son muy sensibles a los cambios en la osmolaridad. Por lo tanto, asegúrese de minimizar la evaporación del tampón de imágenes. Para tratamientos más prolongados, la cámara de imágenes debe cubrirse con una tapa. - Agregue 500 μL de solución 4x DA a la cámara y grabe 6 imágenes más (calibración máxima de 3 min).
- Aspire el tampón de la cámara de imágenes y reemplácelo con 1 ml de 1x solución de DTT. Graba 10 imágenes más (calibración mínima de 5 min).
- Finalice la grabación y guarde la serie de imágenes.