Microinyección de cerebro de roedores con una microaguja de cuarzo

Resumen

Fuente: Paolone, G., et al. Agujas personalizadas para microinyecciones en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra una inyección de microagujas de cerebro de roedores utilizando una microaguja de cuarzo con agujeros. La microaguja se conecta a una jeringa y una microbomba para controlar la velocidad de administración. La aguja con la solución inyectable se inserta en el cerebro con la velocidad de administración establecida en baja. Una vez posicionado, se aumenta la velocidad de entrega. La aguja se retira después de una breve pausa.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de agujas de cuarzo

1. Limpie y esterilice los capilares de cuarzo (ver Tabla de materiales) colocándolos durante 5 min en agua destilada, 5 min en etanol al 99% y 5 min en dietilo-éter.
2. Deje los capilares debajo de la campana durante al menos 1 h para que se sequen por completo.
3. Prepare las agujas con un extractor láser de acuerdo con parámetros que permitan la producción de una aguja suficientemente larga y lo suficientemente delgada, según las necesidades individuales.
   NOTA: Utilizamos un extractor láser (consulte la Tabla de materiales). Use un programa de dos líneas para tirar. La primera línea utiliza alta potencia, la mayor longitud de escaneo (correspondiente al VALOR DEL FILAMENTO) y sin fuerza de tracción. Esta combinación de parámetros conduce a la fusión de la porción más grande del capilar con la velocidad de extensión más baja, lo que permite dar forma a una aguja larga con un gran tamaño interno / externo y un vástago reducido. De esta forma, la aguja conserva una alta resistencia mecánica y un amplio diámetro interior que permite el paso de células madre o partículas virales sin obstruirse. La velocidad y el retraso de esta línea de programa deberían detener la extensión capilar antes de que la punta se vuelva demasiado pequeña y larga, perdiendo las características mecánicas y de forma requeridas. La segunda línea del programa de tracción se ejecuta automáticamente una vez que el cuarzo se enfría (5 s). Los parámetros de potencia, filamento y fuerza de tracción son funcionales para cortar una punta con la longitud de punta más corta posible y un vástago empinado, evitando la separación de las dos agujas con una ruptura de la punta. Rutinariamente, con nuestro equipo, usamos lo siguiente: (a) Línea 1 = potencia 990, filamento 5, velocidad 130, retardo 110, tracción 0; (b) Línea 2 = potencia 970, filamento 3, velocidad 0, retardo 70, tracción 0.
4. Poner las agujas en una placa de Petri previamente limpiada con etanol al 70%.
   1. Cubre el plato con una película de parafina de plástico.
5. Cortar los capilares con el microdisector.
   1. En el arranque, deje que el láser ejecute un proceso de autocalibración para verificar la potencia y la energía entregadas. Luego, configure los parámetros de corte.
      NOTA: Utilizamos un microdisector (ver Tabla de materiales) y los siguientes parámetros: energía de pulso de potencia láser (63 μJ), diámetro del rayo láser del 20% de la apertura máxima (apertura máxima: 1.0 μm) y velocidad de corte del 10% de la velocidad máxima (velocidad máxima: 30 μm/s).
   2. Fije firmemente la aguja en la mesa del microscopio y coloque su punta en el centro de la pantalla de la computadora.
   3. En la barra de menú, haga clic en el icono del lápiz y utilícelo para dibujar una marca para el corte por láser de la aguja.
      NOTA: El corte debe estar en un ángulo de aproximadamente 45° con respecto a la superficie de la aguja.
   4. En la función de barra lateral, seleccione la bandera que contiene el botón "START CUT" para permitir que el láser corte el punto previamente marcado.
   5. Si es necesario, corte los orificios laterales repitiendo los procedimientos descritos en 1.5.2-3; no es necesario volver a colocar la aguja (Figura 1).
6. Limpieza posterior al corte.
   1. Conecte la aguja a una bomba vacía a través de un tubo de plástico.
   2. Encienda la bomba y ajuste manualmente el caudal de avance a una velocidad moderada (3 μl/min).
   3. Aspira primero el etanol al 99% y luego el agua destilada para eliminar las impurezas debidas al corte.
   4. Aspire el etanol al 99% nuevamente para facilitar el secado.
      NOTA: Cada paso debe durar al menos 3 min.
7. Guarde las agujas en una placa de Petri debidamente cubierta hasta el día de la cirugía.
8. Las agujas se pueden reutilizar; al final del experimento, limpiar con lejía y etanol para eliminar la solución y los posibles residuos de tejido. Para una limpieza más completa, coloque las agujas en un frasco de almacenamiento de micropipetas con la punta apuntando hacia abajo, llene el frasco con agua destilada hasta cubrir las puntas, hierva durante 1,5 minutos para eliminar cualquier resto de tejido, luego lave con etanol.

2. Procedimiento

1. Siguiendo las instrucciones proporcionadas por el manual del usuario de la bomba, seleccione el menú de configuración para calibrar la bomba de acuerdo con el diámetro/volumen de la jeringa de microinyección y ajuste el caudal a 0,3 μL/min.
2. Llene una jeringa de 10 ml equipada con una aguja roma (p. ej., aguja Hamilton, 30 G) y un tubo corto de politetrafluoroetileno con agua estéril y utilícelo para llenar la jeringa de microinyección (después de haber retirado el pistón con mucho cuidado) y el kit de piezas del conjunto de inyección para la bomba de microinyección manual (MMP).
   NOTA: El kit MMP se utiliza para montar de forma segura la aguja en el marco estereotáctico (Figura 2). El kit incluye un tubo de politetrafluoroetileno, un acoplador luer a tubo, un soporte para pipetas y juntas para pipetas con diferentes diámetros exteriores.
3. Conecte la aguja al kit MMP.
   1. Enjuague más agua a través del sistema a través de la jeringa de 10 ml y verifique si el agua sale de la aguja.
      NOTA: Asegúrese de eliminar las burbujas de aire dentro del sistema repitiendo los pasos de llenado.
4. Desconecte la jeringa de 10 ml de la jeringa de microinyección mientras empuja lentamente el pistón para dejar una gota de agua en la parte superior de la jeringa de microinyección. Inserte el pistón en la jeringa de microinyección.
5. Conecte la jeringa de microinyección a la bomba y ajuste el caudal a 0,3 μl/min.
   NOTA: Espere hasta que salga una gota de la punta de la aguja y déjela ir durante otros 3 minutos.
6. Ajuste el flujo a 0,1 μL/min e inicie el procedimiento quirúrgico. La bomba debe estar funcionando mientras se realiza la cirugía.
   NOTA: Para los experimentos informados en este artículo, utilizamos ratas Sprague Dawley macho de 300 g (3 meses de edad). Sin embargo, el procedimiento es aplicable a otras especies, en particular a los ratones.
7. Induzca la anestesia general utilizando un método aprobado por las regulaciones locales.
   NOTA: Usamos una mezcla de inyección intraperitoneal (i.p.) de 85 mg / kg de ketamina y 8 mg / kg de xilacina durante 20-50 min de anestesia. Es importante que se utilicen pellizcos en la cola y/o los dedos de los pies para garantizar que el animal esté completamente sedado. El nivel de anestesia y los signos vitales básicos se evalúan antes de que comience la cirugía y se controlan cada 10 minutos mientras se realiza la cirugía. La temperatura corporal del animal se mantiene constante antes, durante y después de los procedimientos quirúrgicos utilizando una almohadilla térmica de recirculación de agua. Los animales son monitoreados hasta que se recuperan por completo (p. ej., están erguidos y son ambulatorios). Además, los animales reciben analgésicos (tramadol, 5-7 mg/kg i.p.) después de la operación cada 24 horas durante tres días.
   1. Afeitar la cabeza del animal y preparar adecuadamente el sitio quirúrgico para la cirugía aséptica. Realice un exfoliante en dos etapas con una solución a base de yodo (Betadine) seguida de etanol al 70%. Además, para mantener la asepsia, envuelva el sitio quirúrgico con un paño quirúrgico (en el video se ha omitido con fines de demostración).
8. Coloque la rata en el marco estereotáxico sobre una manta calefactora de recirculación de agua. Para proporcionar un alivio adicional del dolor, en el sitio de la cirugía, aplique una solución de lidocaína al 0,5% (no exceda los 7 mg / kg). Esterilizar previamente todos los instrumentos quirúrgicos con un esterilizador de perlas o desinfección líquida en frío sumergiendo el equipo en glutaraldehído al 2% más fenol al 7,05% (esporodicina o Cidex), seguido de un enjuague con agua estéril o solución salina. La desinfección debe realizarse incluso entre procedimientos. Haga un corte longitudinal sobre el cráneo con un bisturí esterilizado. Sea cuidadoso para evitar el sangrado excesivo. Abra el cuero cabelludo con una espátula plana y aplique clips quirúrgicos en los colgajos de piel para mantenerlo abierto. Muy suavemente, separe el periostio para exponer el bregma y el área del cráneo a través de la cual se insertará la aguja.
9. Monte el brazo en el marco estereotáxico (mientras el flujo está en curso) y mueva la punta de la aguja exactamente encima del bregma, prestando atención a no romper su punta. Anote las coordenadas antero-posterior y medio-lateral del bregma y traduzca a las coordenadas deseadas. Guiado por un estereomicroscopio, bajar la aguja hasta que su punta casi toque el cráneo, marcar el punto de perforación después de levantar un poco el brazo estereotáxico.
10. Taladre (punta de taladro Ø: 0,8 mm; velocidad de taladro: 1.000 rpm) el cráneo en el punto marcado. Se debe tener cuidado de no penetrar la duramadre durante los procedimientos de perforación. Durante la perforación, gotee solución salina estéril para evitar daños óseos y necrosis.
11. Corta un pequeño trozo de película de parafina de plástico y colócalo sobre el cráneo. Con la pipeta de 10 μl, haga una gota de la solución para inyectarla en la película de parafina de plástico. Detenga la bomba, recupere ligeramente el empujador de la bomba y cree una pequeña burbuja de aire en el capilar tirando suavemente del pistón de la jeringa de microinyección.
12. Baje el brazo estereotáctico hasta que la punta de la aguja llegue a la gota. Extraiga la muestra tirando (muy lentamente) del pistón de la jeringa de microinyección, evitando la formación de burbujas. Vuelva a colocar el empujador de la bomba en contacto con el pistón y encienda la bomba a un caudal de 0,3 μl/min. Espere la formación de una gota (unos minutos) antes de continuar con el siguiente paso.
    NOTA: En el presente experimento de ejemplo, se infundió líquido cefalorraquídeo artificial (LCAa) en el cuerpo estriado [AP (anteroposterior): +1,5, ML (mediolateral): ±2,7; DV (Dorsoventral): -5,0] y en el hipocampo dorsal (AP: -3,5, ML: ±2,1; DV: -3,5; en mm de duramadre), 2 μL/sitio. Para facilitar la comparación entre los dos métodos de inyección, cada área del cerebro se infundió con una aguja de cuarzo en un hemisferio y una punta roma de 26 G o una aguja de acero inoxidable con punta biselada de 30 G en el otro.
13. Baje el flujo a 0,1 μL / min, corte la duramadre con una aguja de punta biselada de acero inoxidable y baje lentamente el brazo estereotáctico en el eje dorso-ventral, ingresando al tejido cerebral. Cuando se alcance la posición deseada, baje 0,1 mm adicionales, detenga la bomba, levante el brazo estereotáctico 0,1 mm y vuelva a poner en marcha la bomba con un flujo de 0,3 μL/min.
    NOTA: La razón para mantener un flujo lento mientras se baja la aguja es asegurar una presión positiva que evite la penetración de pequeños fragmentos de tejido en la propia aguja. Tal evento obstruiría la punta, perjudicando la entrega de la solución. Dado que el caudal es muy lento al bajar la aguja y la velocidad de descenso es de aproximadamente 10 s / mm, esto implica que las cantidades de solución que quedan a lo largo de la trayectoria de la aguja son insignificantes en comparación con las inyectadas en el sitio objetivo. Esta precaución puede evitarse cuando se utilizan agujas con orificios laterales.
14. Inicie el temporizador y espere el tiempo necesario en función del volumen deseado para inyectar (por ejemplo, 6 min 40 s si se inyecta 2 μL). Controle el movimiento de la burbuja mientras se inyecta. Al final, detenga la bomba y espere 5 minutos antes de recuperar lentamente la aguja. Cuando la aguja de cuarzo esté completamente extraída, vuelva a encender la bomba y verifique la formación de una gota en la punta de la aguja.
15. Selle la abertura en la superficie del cráneo con cera ósea, retire los clips hemostáticos y suture el cuero cabelludo, cubra el área alrededor de la herida con una crema antibiótica (por ejemplo, neosporina) y devuelva al animal a la jaula de su casa.

Resultados

Figura 1: Imagen microscópica de la punta de una aguja de cuarzo, que muestra diferentes diámetros de la punta y los orificios empleados para la inyección de fluidos. Imagen de bajo aumento en (A) y mayor aumento en (B) y (C). La aguja se pued...

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