Imágenes tridimensionales de astrocitos inmunomarcados mediante microscopía confocal

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal correspondiente.

1. Animales, cirugía y preparaciones de muestras

NOTA: Prepare el tejido cerebral para el análisis microscópico confocal tridimensional (3D).

1. Divida a los animales al azar en dos grupos: beta amiloide (Aβ)_1-40\u2012inyección (n = 8) y Aβ_1-40\u2012inyección con tratamiento con genisteína (n = 8); administre genisteína (10 mg/kg diluidos en un vehículo como aceite de ricino polietoxilado) por sonda 1 hora antes de la cirugía.
2. Anestesiar a los animales con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Confirme la anestesia adecuada por la falta de reflejo de abstinencia después de pellizcar el dedo del pie. Use ungüento en los ojos durante la cirugía para prevenir la sequedad.
3. Coloque a los animales en aparatos estereotáxicos y afeite la cabeza. Aplique solución de yodo para limpiar el cuero cabelludo antes de la incisión y mantenga el sitio de la operación estéril durante la cirugía para reducir el riesgo de infección. Inyecte Aβ_1-40 estereotáxicamente (4 μl) en el hipocampo a -3,5 mm posterior al bregma, ± 2 mm lateral a la línea media y -2,8 mm por debajo de la duramadre, según el atlas del cerebro de rata.
4. Proporcionar observación/cuidado postoperatorio hasta que los animales estén completamente conscientes para garantizar la comodidad de los animales. Mantenga a los animales calientes durante la recuperación y no los devuelva a una jaula con otros animales hasta que se recuperen por completo. Preste atención a cualquier signo de infección en los animales después de la cirugía.
5. Anestesiar profundamente a los animales con ketamina (150 mg / kg) tres semanas después de la cirugía. Realice la fijación transcárdica perfundiendo a los animales con solución salina al 0,9% seguida de paraformaldehído al 4% en solución salina tampón de fosfato 0,1 M o PBS (pH = 7,4), luego retire y fije el cerebro.
6. Post-fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% durante 2-3 días a 4 °C.
7. Incruste el tejido en bloques de parafina mediante el uso de equipos de inclusión de tejido y evite llenar o llenar demasiado el casete, ya que puede interferir con la alineación o el corte correctos. Preste atención a la orientación del tejido en el bloque de parafina.
   NOTA: El hipocampo de rata, por ejemplo, está cerca de la parte posterior del hemisferio cerebral. Por lo tanto, el tejido debe incrustarse de manera que la sección comience en la parte posterior del cerebro. Utilice el atlas de Paxinos como guía para alcanzar la estructura anatómica deseada.
8. Coloque el micrótomo lejos de corrientes de aire o puertas, ya que los movimientos de aire dificultan el manejo de las secciones.
9. Utilice secciones con un espesor ≥20 μm, ya que esta profundidad será necesaria para producir imágenes Z-Stack de astrocitos completos. No use el primer par de secciones, ya que pueden tener un grosor no deseado debido a la expansión térmica.
10. Coloque las secciones en la superficie de agua tibia (5 ± 2 °C, por debajo de la temperatura de fusión para la parafina) el tiempo suficiente para aplanar las secciones.
    NOTA: La sobreexpansión de la sección puede alterar la morfología de la estructura. Use un pincel pequeño para transferir secciones con cuidado. Reúna dos o tres secciones en cada diapositiva.
11. Guarde las diapositivas en una rejilla vertical y déjelas secar a 37 °C durante varias horas o durante la noche (O/N).

2. Inmunohistoquímica

1. Desparafinar secciones en xileno, 2 x 10 min, y rehidratar a través del gradiente de alcohol (99,8%, 95% y 70%, 10 min cada uno) y PBS.
2. Incubar con anticuerpos contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) diluida 1:1.500 en PBS que contiene 0,25% de albúmina sérica bovina (BSA), 0,25% de Tritón X-100 y 3,5% de suero normal (O/N a 4 °C).
3. Lave las secciones en PBS durante 3 x 5 min.
4. Incubar con anticuerpos conjugados con fosfato alcalino secundario durante 1 h (1:100, 21 °C, diluido en PBS).
5. Lave las secciones en PBS durante 3 x 5 min.
   NOTA: Es importante lavar las secciones adecuadamente después de los anticuerpos secundarios para minimizar la tinción de fondo.
6. Incube las secciones en la oscuridad con Chromogen Rojo Permanente Líquido (15-20 min).
   Nota: Prepare la solución no más de 30 minutos antes de usarla.
7. Lave las secciones en PBS durante 3 x 5 min.
8. Finalmente, tiña los núcleos con 4-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1:500, diluido en PBS) antes del deslizamiento de cobertura. Guarde los portaobjetos en el refrigerador durante 24-48 horas antes de la microscopía.

3. Microscopía confocal

NOTA: Para una evaluación cuantitativa (ver más abajo), seleccione un astrocito con un núcleo teñido con DAPI claramente visible con un mínimo de ramas superpuestas para reducir el riesgo de errores. La producción de imágenes Z-Stack requiere mucho tiempo. Tenga paciencia y no se detenga durante el procesamiento. Se utiliza un microscopio de escaneo láser confocal vertical para crear imágenes 3D de astrocitos.

1. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y seleccione el objetivo 63X.
2. Abra el software de imágenes y haga clic en Iniciar sistema. Haga clic en la pestaña Localizar. Vaya a Asignar y seleccione GFP para ajustar la luz adecuada.
3. Abra el obturador para reflejar la luz. Busque el revólver reflector en el lado derecho del obturador y elija el color que deben reflejar los astrocitos (verde, rojo o violeta); aquí se utilizó el color rojo (FSet20 wf).
   NOTA: No olvide enfocar la imagen directamente en el ocular del microscopio.
4. Para encontrar el mejor enfoque, haga clic en Todo cerrado, coloque el pin del microscopio en modo de pantalla y haga clic en la pestaña Adquisición.
5. Haga clic en Configuración inteligente en la pestaña Adquisición; se abre una ventana. Seleccione el fluoróforo adecuado (es decir, DAPI y Alexa Fluor 555, en el proyecto actual) de la lista. El color se selecciona automáticamente.
6. Haga clic en Mejor señal y Aplicar, luego haga clic en Establecer exposición; la computadora establecerá automáticamente los parámetros de exposición.
7. Para optimizar la imagen, vaya a la ventana Canales. Desmarca Pista2, resalta Pista1 y haz clic en En vivo. Concéntrese en la imagen si es necesario.
8. En la ventana Canales, ajuste las siguientes teclas; haga clic en 1AU para optimizar automáticamente el estenopeico. Es muy importante hacer este paso, de lo contrario las imágenes confocales no serán óptimas. Ajuste la ganancia para tener la mejor intensidad (mantenga esta configuración por debajo de 800 para reducir el ruido adicional). Finalmente, establezca la ganancia digital entre 2 y 3.
9. Desmarca Pista1, haz clic en Pista2 y repite el Paso 3.8 para Pista2. Luego detén Live.
10. Vaya a la ventana Modo de adquisición. Mejore la imagen optimizando el tamaño de fotograma y el promedio. Para cambiar el tamaño del marco, vaya a X * Y y seleccione 1,024 x 1,024. Elija una velocidad lenta para crear una mejor imagen.
11. Vaya a Promedio y seleccione un número ≥4. Este valor de promedio indica el número de escaneos que se promediarán para producir la imagen adquirida. Ahora, haga clic en el botón Ajustar y guarde la imagen 2D capturada.
12. Para obtener imágenes 3D, marque el elemento Z-Stack en Configuración inteligente, lo que hará que se abra la ventana Z-Stack.
13. Establezca la primera y la última posición para la pila Z, es decir, la profundidad de la celda. Primero, haga clic en Live. Luego use la unidad de enfoque del microscopio para enfocar la posición más alta del astrocito en el tejido, donde comenzará el Z-Stack. Haga clic en Establecer primero. Luego, enfoque hacia abajo hasta la posición más baja del astrocito en el tejido, donde se debe detener el escaneo Z-Stack. Haga clic en Establecer último. Luego detén Live.
14. Elija el intervalo; se utiliza 1,01 μm en el estudio actual; la elección del intervalo se puede hacer haciendo clic en Óptimo para establecer el número de cortes.
15. Haga clic en Iniciar experimento. Guarde las imágenes una vez que se complete el escaneo. Esta imagen se utilizará para la medición de los siguientes parámetros: área de superficie y volumen del territorio de astrocitos, así como todo el astrocito, incluidas las ramas, el cuerpo celular y el núcleo.