Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Inyecciones intramusculares en las placas terminales del motor
- Tire de las micropipetas de vidrio con un extractor de micropipetas (se recomienda el uso de micropipetas graduadas con émbolos). Con la ayuda de un microscopio de disección, rompa las puntas de las micropipetas con un par de pinzas de modo que el diámetro interno de la luz de la micropipeta sea de aproximadamente 0,5 mm.
- Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos utilizados estén recién esterilizados en autoclave y que el área quirúrgica sea estéril.
- Llene las micropipetas con Fluoro-Gold (5% en agua destilada).
- Inducir anestesia en el animal usando isoflurano (4% en O2) en una cámara de inducción. Compruebe el reflejo de adrizamiento y asegúrese de su ausencia antes de sacarlo de la cámara de inducción. Asegure un cono nasal sobre el hocico de la rata y administre isoflurano (2% en O2) para mantener la anestesia. Pellizque los dedos de los pies del animal y toque suavemente el ojo del animal para asegurarse de que tanto la retirada del pedal como los reflejos corneales estén ausentes.
NOTA: También se puede utilizar una mezcla de ketamina y xilacina (80 y 10 mg/kg, respectivamente, administrados por vía intraperitoneal). La ketamina es una droga de la Lista 8 ("Controlada"), y se deberán cumplir los protocolos necesarios asociados con la compra, el uso, el almacenamiento y la eliminación de la droga. - Aplique lubricante ocular para evitar la sequedad de los ojos durante el transcurso del procedimiento.
- Afeite la extremidad objetivo y use una gasa para limpiar el área afeitada con tres exfoliantes alternos de clorhexidina y alcohol al 70%. Transfiera al animal al área quirúrgica.
- Coloque al animal en una almohadilla limpia y colóquelo adecuadamente para garantizar un buen acceso a los músculos objetivo.
- Use un par de fórceps con agarraderas para los dientes para levantar la piel sobre el músculo objetivo lejos de la musculatura subyacente y haga una incisión en la piel con unas tijeras quirúrgicas. Asegúrese de que la incisión sea lo suficientemente grande como para exponer completamente los músculos de interés. Asegúrese de que haya una interrupción mínima en la fascia.
- Utilice las fotografías de la placa terminal motora (MEP) para transponer mentalmente la ubicación y la forma de la región MEP en los músculos.
NOTA: Un marcador de fieltro fino podría ayudar a reproducir la región MEP de la fotografía en los músculos de interés. - Realice múltiples inyecciones a lo largo de toda la región MEP (para Fluoro-Gold, 3 a 4 inyecciones de 1-2 μl cada una deberían ser suficientes). Limpie suavemente los músculos para eliminar cualquier filtración.
- Acerque los dos extremos de la piel incisa con unas pinzas romas y cierre la herida con clips quirúrgicos. Infiltrar 0,1 ml de bupivacaína (0,5% en agua) (u otros anestésicos locales) a lo largo de toda la herida.
- Apague la máquina de anestesia y controle al animal hasta que se haya recuperado por completo de la anestesia.
- Esperar 14 días entre la administración de inyecciones intramusculares y la perfusión de los animales.
