Administración dirigida de ARNip a las neuronas para el silenciamiento de proteínas priónicas mediante complejos liposomales

Resumen

Fuente: Bender, H. R., et.al. Entrega de ARNip terapéutico al SNC mediante liposomas catiónicos y aniónicos. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la administración dirigida de ARNip de proteína priónica (PrP) a las neuronas utilizando complejos liposomales de ARNip-péptido (LSPC). Los liposomas catiónicos se unen electrostáticamente al ARNip dirigido a PrP, que se estabiliza aún más con el péptido RVG-9r para el transporte mediado por receptores a través de la barrera hematoencefálica. Una vez dentro del cerebro, las LSPC sufren endocitosis en las neuronas, liberando ARNip para iniciar la interferencia de ARN, reduciendo la expresión de PrP e interrumpiendo la progresión de la enfermedad priónica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Preparación de LSPC:

1. use una proporción de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano) de 1: 1: colesterol para LSPC. Para una preparación de liposomas de 4 nmoles, mezcle 2 nmoles de DOTAP y 2 nmoles de colesterol en 10 ml de una solución de cloroformo:metanol 1:1 en un matraz.
2. Evaporar 9 ml de la solución de cloroformo:metanol utilizando gas N₂ en una campana extractora. Evapore el último 1 ml de disolvente en una campana extractora durante la noche sin gas. Observe una fina película lipídica en el fondo del matraz.
3. Calentar 10 ml de una solución de sacarosa al 10% a 55 °C.
4. Vierta la solución de sacarosa al 10% calentada sobre la fina película lipídica lentamente, es decir, 1 ml/min, mientras agita suavemente el matraz. Mantener la sacarosa al 10% y el matraz con lípidos a 55 °C para que las moléculas lipídicas permanezcan en la fase gel-líquido. La rehidratación da como resultado la formación de vesículas multilamelares (MLV).
5. Deje que los lípidos se rehidraten a 55 °C durante al menos una hora antes de dimensionar los liposomas.
6. Ensamble una extrusora según las instrucciones del fabricante con filtros de 1.0 μm o use filtros de jeringa de 1.0 μm para dimensionar.
7. Agregue 1 ml de la suspensión de liposomas calentada a una de las jeringas del extrusor y pase la suspensión entre las dos jeringas 11 veces. Asegúrese de que la suspensión esté en la jeringa opuesta a la jeringa inicial después de las 11 pasadas.
8. Vuelva a dimensionar los liposomas a través de filtros de 0,45 μm y luego de 0,2 μm para generar vesículas unilamelares (LUV) grandes. Mantenga la suspensión de liposomas caliente para facilitar el tamaño.
9. Incube 20 μl de la suspensión de liposomas de 4 nmole (200 μM) con 200 μl de una solución de ARNip madre de 20 μM (4 nmole en total) durante 10 min a temperatura ambiente.
10. Incube 80 μl de una solución de RVG-9r de 500 μM (40 nmole en total) con la solución de ARNip/liposoma durante 10 min a temperatura ambiente. Los LSPC deben usarse lo antes posible, pero se pueden usar hasta varias horas después de la preparación. Almacene los LSPC a 4 °C durante varias horas después de la preparación.

2. Inyectar ratones con LSPC

1. Exponga a los ratones durante 5-10 minutos a una lámpara de calor para dilatar la vasculatura.
2. Anestesiar al ratón con un flujo de isofluorano/oxígeno al 2-3% 5-10 min antes de la inyección y durante la inyección. Confirme la anestesia cuando el animal ya no esté deambulante y las respiraciones se hayan ralentizado, pellizcando el dedo del pie. Coloque el ratón boca arriba o de lado para acceder a la vena de la cola. Use ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar que se sequen mientras está bajo anestesia.
3. Limpie / rocíe la cola con EtOH al 70% e inyecte 300 μl de LSPC en la vena de la cola del ratón con una jeringa de insulina de 26 G. Comience a inyectar distalmente en la vena de la cola y muévase proximalmente si la vena colapsa o se rompe.
4. Coloque al ratón en una jaula limpia hasta que mantenga la decúbito esternal. No coloque al ratón con otros compañeros de jaula hasta que se haya recuperado por completo. Los ratones deberían recuperarse en 5 a 15 min. Se pueden colocar en una almohadilla térmica o debajo de una lámpara de calor para mantener la temperatura corporal si la recuperación lleva más tiempo. Los ratones deben ser monitoreados de cerca para protegerse contra el sobrecalentamiento.
5. Controle al animal varias horas después de la inyección para asegurarse de que el efecto de la anestesia desaparezca y que no haya efectos nocivos del tratamiento. Deje que los LSPC circulen durante al menos 24 horas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DOTAP	lípidos Avanti Lípidos	890890
Colesterol	Avanti Lipids	700000
Cloroformo	Fisher Scientific	AC268320010
Metanol	EMD Millipore	113351
N₂ Gas	AireGas
Sacarosa	Fisher Scientific	S5-500
Extrusora	Avanti Lipids	610023
filtros de 1,0, 0,4 y 0,2 μm	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006