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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal correspondiente.
1. Ensayo de proliferación celular Ki67
- Ensayo de proliferación celular Ki67 (inmunocitoquímica)
- Enjuague los cultivos celulares con tampón de fosfato 0,1 M (PO4) durante un minuto dos veces. Fije el cultivo con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 min a temperatura ambiente. Retire el PFA y enjuague los pocillos con PBS durante siete minutos tres veces.
- Después del enjuague final, agregue 100 μl de solución bloqueadora (solución salina tampón de fosfato, suero de burro normal al 5%, suero de albúmina bovina al 0,4% y Triton X-100 al 0,2%) a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 1 hora. Prepare el anticuerpo primario, anti-Ki67 de conejo, diluyendo en solución bloqueadora en una proporción de trabajo de 1:200.
- Retire la solución bloqueante y aplique 100 μl de la solución de anticuerpos primarios en cada pocillo. Cubra la placa de 96 pocillos e incube las muestras a 4 °C durante la noche.
- Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos y enjuague con PBS durante 7 min, 3 veces.
- Prepare el anticuerpo secundario, burro anti-conejo Cy3 en solución bloqueadora en una proporción de trabajo de 1:500. Agregue la tinción nuclear DAPI a la solución de anticuerpos secundarios a una dilución de 1:100. Después de retirar el último enjuague de PBS, aplique 100 μl de la solución secundaria de anticuerpos/DAPI en cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 90 min.
- Retire la solución secundaria de anticuerpo/DAPI y enjuague cada pocillo con PBS durante 7 min, 3 veces. Cubra la placa de 96 pocillos y guárdela a 4 °C hasta obtener imágenes.
2. Imágenes automatizadas y análisis de puntuación de múltiples longitudes
- de onda Cargue una placa de 96 pocillos (previamente procesada para el inmunoetiquetado Ki67) en el sistema HCS y deje que la placa se equilibre durante 20 minutos. Abra el software de adquisición y análisis de imágenes del sistema HCS.
- Elija la configuración de adquisición para el objetivo 10X utilizando el binning de cámara en 1 y una configuración de ganancia de 2. Encuentre el plano Z en el que residen las celdas utilizando la función Exposición automática y calcule el desplazamiento para cada longitud de onda de interés. Para este análisis, capture imágenes para DAPI (W1), Cy3 (W2). Elija el nivel de intensidad máximo en el que los pocillos de control negativos no muestran ninguna señal para la adquisición de imágenes. Confirme que esta configuración es adecuada para los pocillos positivos.
- Adquirir placa. Capture imágenes y guárdelas en la base de datos del software de adquisición y análisis de imágenes.
- Una vez que se hayan adquirido las imágenes, abra el software de adquisición y análisis de imágenes fuera de línea y revise los datos de la placa de las imágenes adquiridas anteriormente.
- Seleccione el análisis de puntuación de longitud de onda múltiple. Configure las intensidades mínima y máxima para cada longitud de onda.
NOTA: La detección DAPI debe marcar la tinción alrededor de cada núcleo visible. Cy3 debe detectar las células positivas con inmunorreactividad (RI) Ki67 y no debe detectar IR en los controles negativos. Para Cy3 Ki67 IR, el ancho mínimo aproximado fue de 7 μm, el ancho máximo aproximado fue de 30 μm, la intensidad sobre el fondo local fue de 150 niveles de gris y el área mínima teñida fue de 50 μm2. - Ejecute análisis para todas las posiciones. Exporte los datos para verlos en una hoja de cálculo.