Resección de tumores cerebrales en un ratón mediante un sistema de resección mínimamente invasivo

Resumen

Fuente: Alomari, S., et al. Implementación de la resección de tumores cerebrales mínimamente invasivos en roedores para la recolección de tejidos de alta viabilidad. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra el uso de un sistema de resección mínimamente invasivo (MIRS) para extirpar el tejido tumoral de un ratón anestesiado implantado con un tumor. El procedimiento consiste en asegurar el ratón en un marco estereotáctico, reabrir el sitio quirúrgico anterior para acceder al cerebro e insertar una cánula especializada que utiliza succión y una cuchilla giratoria para extirpar secciones del tumor. Después de la resección, el tejido extirpado se recolecta a través de un tubo estéril y la herida se cierra para permitir la recuperación.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Implantación inicial de tumor intracraneal

1. En la fase inicial del estudio, inyectar intracranealmente a cada ratón 100.000 células (línea celular de glioma murino GL261) suspendidas en 4 μL de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) a una profundidad de 2,5 mm siguiendo el informe publicado anteriormente.
2. Cuantifique la señal tumoral en cada ratón utilizando el sistema de imágenes in vivo 9 días después de la implantación del tumor.
   NOTA: Si es necesario, estratifique los ratones en dos grupos según la carga tumoral. En el presente estudio, los dos grupos fueron: (1) ratones con una carga tumoral relativamente pequeña (señal bioluminiscente media = 5.5e + 006 ± 0.1e + 006 fotones / s, n = 10) y (2) ratones con una carga tumoral relativamente grande (señal bioluminiscente media = 1.69e + 007 ± 0.2e + 007 fotones / s, n = 10), (p < 0.05, prueba de Mann-Whitney).
3. Divida cada grupo en dos subgrupos comparables.
   >NOTA: En este estudio, los dos subgrupos fueron: ratones no tratados (n = 5) y ratones con tumores sometidos a resección quirúrgica mediante MIRS (n = 5), (p > 0,05, prueba de Mann-Whitney).
4. A partir del día de la resección, realice un seguimiento de la progresión del tumor utilizando el sistema de imágenes in vivo con una frecuencia basada en el patrón de crecimiento tumoral.
   NOTA: Para la línea celular GL261, realice un seguimiento de la progresión del tumor el día de la resección y luego cada 3-6 días.

2. Resección tumoral con MIRS

1. Anestesiar al ratón con una mezcla de gas isoflurano-O₂ en una cámara de inducción o inyección intraperitoneal de solución de xilacina/ketamina.
   1. Si usa el anestésico gaseoso, ajuste el caudal de gas a 1.0 ml / min y el vaporizador al 2.0% para la inducción de anestesia, lo que generalmente requiere de 3 a 5 minutos en la cámara (consulte la tabla de materiales).
   2. Si usa el anestésico inyectable, anestesiar a los ratones inyectando 0,2 ml de solución anestésica (80-100 mg / kg de ketamina y 10-12,5 mg / kg de xilacina, ver Tabla de materiales) por vía intraperitoneal.
2. Evalúe al animal para una sedación adecuada pellizcando el dedo del pie. Aplicar ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad de la córnea. Administrar un analgésico (0,03-0,06 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea) antes del procedimiento.
3. Coloque el ratón en el marco estereotáctico (consulte la Tabla de materiales) una vez que se haya confirmado la sedación completa.
   NOTA: Si utiliza el anestésico gaseoso, coloque la nariz del ratón en un cono nasal donde continuará recibiendo la mezcla de isoflurano-O₂ durante el procedimiento (1,5%).
4. Retire la grapa anterior, luego elimine el vello con una crema depilatoria o afeitándose. Desinfecte la piel con ciclos alternos de un exfoliante a base de clorhexidina / betadine y alcohol. Luego, con un bisturí estéril, cree una incisión longitudinal en la línea media de 1 cm a lo largo de la cicatriz quirúrgica anterior.
5. Conecte la pieza de mano MIRS al brazo estereotáctico a través del adaptador de platina / soporte de la pieza de mano para mejorar la estabilidad y la precisión.
6. Configure la máquina MIRS (consulte la tabla de materiales) utilizando los siguientes ajustes (Figura 1).
   1. Inserte el cable de alimentación colocado en el panel posterior en el receptáculo del cable de alimentación. Encienda o apague la alimentación del sistema alternando (1 = ENCENDIDO, 0 = APAGADO).
   2. Inserte un extremo de la manguera de nitrógeno (suministrada con la consola) en el accesorio macho en el panel trasero de la consola. Gire la tuerca de conexión en el sentido de las agujas del reloj para apretar la conexión.
      NOTA: El extremo opuesto de la manguera debe estar conectado al suministro de nitrógeno.
   3. Antes de conectar la manguera al suministro de nitrógeno, confirme que la presión de suministro no exceda los 100 psig, que es la presión de suministro de entrada recomendada para la consola.
      NOTA: La consola generará su propia aspiración cuando se active con el pedal una vez que se haya suministrado nitrógeno a la consola.
   4. Asegure la tapa del puerto de vacío y séllela para evitar fugas en el sistema de vacío. Cualquier fuga en el sistema de aspiración afectará el rendimiento de la consola MIRS.
   5. Si la aspiración es inferior a 17 durante la configuración o el cebado, verifique que la perilla de aspiración en la parte frontal de la consola esté configurada en el nivel máximo (100), asegúrese de que no haya fugas en el sistema de aspiración y confirme que la presión de suministro de nitrógeno de entrada sea correcta.
   6. Para conectar el pedal a la consola, inserte el conector gris del pedal en su receptáculo gris hasta que haga clic y encaje en su posición.
      NOTA: El conector del pedal se conecta a la consola en una orientación y está codificado.
   7. Para conectar la pieza de mano a la consola, inserte el conector azul de la pieza de mano en su receptáculo azul hasta que haga clic y encaje en su posición.
      NOTA: El conector de la pieza de mano se conecta a la consola en una orientación y está codificado.
   8. Prepare cada pieza de mano antes de usar el sistema aspirando líquido estéril de un tazón pequeño hacia la abertura, a través del tubo y la pieza de mano, y luego hacia el recipiente para asegurarse de que el interior del tubo y la pieza de mano estén lubricados para reducir las oclusiones de tejido.
   9. Prepárese para la aspiración sola o la aspiración con corte seleccionando el modo apropiado en el panel frontal de la consola. Inicie el uso del pedal.
7. Inserte la cánula MIRS de 23 G en el orificio de la fresa a una profundidad de 2,5 mm.
8. Inicie el proceso de resección presionando el pedal conectado a la cánula. Realice un ciclo completo (360°) o más de resección con la perilla de control de la pieza de mano.
   NOTA: Cuantos más ciclos se realicen, más volumen de tejido tumoral se resecará.
9. Una vez que se complete el proceso de resección, retire la cánula MIRS de 23 G del orificio de la rebaba y use 5 ml de 1x PBS para enjuagar el tubo y desalojar cualquier residuo residual.
10. Retire el ratón del marco estereotáctico y cierre la herida con una grapadora o material de sutura 4-0 (consulte la tabla de materiales).
11. Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica o bajo una luz de calentamiento durante la recuperación de la anestesia antes de devolverlo a su jaula.
12. Una vez completado el experimento, purgue la cánula mediante enjuague. Alterne con medios enfriados y aire para "empujar" todo el tejido resecado de regreso al recipiente de recolección. Retire el recipiente de recolección del sistema y cúbralo con la tapa provista.
13. Después de completar el paso 2.12, coloque la punta distal de la cánula en 3% H₂O₂ y aplique succión a 24-25 in Hg para llenar la línea de succión de regreso al recipiente de recolección de succión y déjela reposar durante 60-90 s. Enjuague con medios estériles pulsando aire y medios de forma intermitente.
14. Monitoree a los ratones para detectar cualquier signo neurológico (movimientos erráticos anormales o convulsiones) después del procedimiento.

Resultados

Figura 1: Configuración del sistema MIRS. (A) Sistema de resección mínimamente invasivo (MIRS) para tumores cerebrales en modelos de roedores con un tejido integrado sistema de conservación. (B) Panel fronta...

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