Efecto sinérgico de la administración intracraneal e intraperitoneal de fármacos analgésicos sobre la respuesta térmica al dolor en una rata

Resumen

Fuente: Martinez, E., et al. Farmacoterapia intracraneal y ensayos de dolor en roedores. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra la administración intracraneal de un fármaco analgésico en una rata anestesiada con una cánula guía preimplantada en la corteza prefrontal. Un fármaco analgésico adicional se administra conjuntamente por vía intraperitoneal. Después de la recuperación, la respuesta al dolor térmico de la rata se evalúa utilizando el aparato de Hargreave, donde se mide la latencia de retirada de la pata para evaluar los efectos analgésicos de los medicamentos administrados.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Implantación de cánula estereotáxica

1. Utilice ratas Sprague-Dawley macho de 10 a 12 semanas de edad.
2. Anestesiar a los animales con isoflurano al 1,5-2%. Una vez que el animal deje de responder a un pellizco fuerte con pinzas afiladas, realice la cirugía. Asegúrese de esterilizar todos los instrumentos en autoclave, usar guantes quirúrgicos estériles y agregar ungüento oftálmico a los ojos del animal para evitar daños.
3. Implante estereotáxicamente cánulas guía bilaterales de calibre 26 en la corteza prefrontal (PFC) en un ángulo de 12,5 grados con coordenadas anteroposterior (AP): +2,9 mm; mediolateral (ML): +/−1,6 mm; dorsoventral (DV): −2,1 mm. Para insertar las cánulas, taladre agujeros en el cráneo en las coordenadas deseadas, con un diámetro de orificio de acuerdo con el tamaño de las cánulas utilizadas.
   NOTA: Aquí, el PFC fue estudiado como el objetivo potencial para los implantes intracraneales debido a su importante papel en el procesamiento del dolor, lo que ha sido demostrado en varios estudios previos. Para estudiar la función de otras áreas específicas del cerebro, los investigadores pueden usar diferentes coordenadas según el atlas cerebral.
4. Permita que las ratas se recuperen de la cirugía durante al menos 1 semana. Después de la cirugía, inyecte líquidos subcutáneos antes de la recuperación para ayudar a mantener los requisitos metabólicos y aplique bupivacaína tópica en la incisión recién cerrada. Coloque al animal en una almohadilla tibia hasta que se despierte y controle al animal después de la operación durante 3 días para garantizar una buena salud y una recuperación adecuada.
5. Una vez que los animales se hayan recuperado por completo de la cirugía, comience las inyecciones (siguiente paso).

2. Inyecciones intracraneales e intraperitoneales

1. Para inyecciones intracraneales, use un tubo PE-50 conectado en un extremo a jeringas Hamilton de 10 μL con una cánula inyectora de calibre 33 que se extiende 1.0 mm más allá de las guías implantadas.
2. Inyecte 0,5 μl (o menos si lo desea) del fármaco del estudio o solución salina en el PFC de estas ratas. Debido a que el PFC es una región más grande en ratas, esta cantidad no se extenderá a otras regiones. Sin embargo, para regiones cerebrales más pequeñas o para ratones, use un volumen más pequeño. La cantidad inyectada dependerá de la región del cerebro y de la especie de animal.
   NOTA: Tenga en cuenta que se debe usar solución salina como control en lugar de dimetilsulfóxido (DMSO) porque el DMSO es neurotóxico. Sin embargo, una cantidad muy pequeña de DMSO puede ser segura para la infusión, ya que los estudios han demostrado que menos del 50% de DMSO (es decir, menos de un volumen total de 0,3 μL, como en este caso) puede no interferir con los estudios de comportamiento.
3. Inyecte el volumen bilateralmente durante un período de 100 s y mantenga las cánulas inyectoras en su lugar durante 60 s adicionales antes de retirarlas para permitir una difusión lenta de esta solución.
4. Para estudios de efectos farmacológicos sinérgicos, administre conjuntamente otro fármaco a través de métodos sistémicos. En este caso, inyecte el fármaco deseado o controle por vía intracraneal y administre un fármaco adicional por vía intraperitoneal inmediatamente después. Como ejemplo, en este estudio, estudiamos los efectos analgésicos sinérgicos de la morfina y las ampaquinas para probar un efecto aditivo. Infundimos una AMPAkine por vía intracraneal, en combinación con la administración intraperitoneal de 1 mg/kg de morfina (una dosis sistémica segura).
   NOTA: Se recomienda que las inyecciones intracraneales se realicen primero, ya que son más difíciles de realizar que las inyecciones intraperitoneales.

3. Ensayos y evaluación de analgesia

1. Para estudiar el efecto de las inyecciones intracraneales en el comportamiento del dolor agudo en ratas, utilice la prueba plantar (prueba de Hargreaves) para calcular la latencia de abstinencia en respuesta a estímulos térmicos. El aparato de Hargreaves enfoca un rayo infrarrojo a través de un plano de vidrio en la pata de la rata; La rata está de pie y se mueve libremente sobre el plano de vidrio. Al realizar la prueba de Hargreaves, enfoque el haz infrarrojo debajo del área plantar del pie de la rata.
   1. Comience realizando pruebas de referencia de Hargreaves antes de las inyecciones para establecer un valor de referencia para la comparación.
2. No se inyecte ningún medicamento de ningún tipo antes de establecer un valor de referencia. Realice cinco buenas pruebas, con 5 minutos de diferencia. Un buen ensayo está indicado por una retirada clara, es decir, cuando la rata dobla la rodilla y levanta el pie hacia arriba y hacia el cuerpo.
   NOTA: Asegúrese de que los ensayos estén separados por 5 minutos para evitar la sensibilización de la rata. El aparato de Hargreaves registra automáticamente el tiempo de retirada, una vez que se rompe el rayo infrarrojo. Como resultado, asegúrese de descartar las pruebas de locomoción, cambio de peso, etc. Si se realiza una prueba con descuento, espere 5 minutos y repita la prueba.
3. Calcule los umbrales de retiro tomando el promedio de los cinco ensayos.
4. Después de obtener un promedio de referencia, comience el experimento para obtener tiempos de abstinencia después de la infusión de medicamentos. Las pruebas de Hargreaves se pueden realizar 20-30 minutos después de las inyecciones intracraneales, aunque el momento preciso puede depender de la farmacocinética de los agentes específicos. Esto es para asegurar que la rata haya absorbido la droga y esté experimentando sus efectos. Realice este experimento de la misma manera que el paso 3.1.
5. Calcule los umbrales de retiro como se menciona en el paso 3.2.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sterotaxic Cannula	PlasticsOne	8I26GA8MMKIT
Jeringa digital	Hamilton	8440
AMPAkine	Sigma Aldrich	C-271
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D4540
Hargreaves Apparatus	Ugo Basile	37370
Ratas macho Sprague-Dawley	Taconic Farms	NTac:SD
Guantes quirúrgicos estériles	Dynarex	6535