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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.
1. Preparación del animal para la cirugía
- Realice procedimientos quirúrgicos en un espacio limpio y dedicado. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y esterilizar con un esterilizador de perlas de vidrio antes de la cirugía.
NOTA: En este protocolo, use ratones FVB postnatales de día 10-12 (P10-12). Se pueden utilizar diferentes edades y cepas de ratones para satisfacer las necesidades de un proyecto específico. Los ratones mayores de P40 pueden ser un desafío porque el hueso de la bulla se vuelve más duro. - Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg / kg), clorhidrato de xilacina (10 mg / kg) y acepromacina (2 mg / kg). Comience la preparación quirúrgica solo después de que el animal ya no responda a estímulos dolorosos, como pellizcos en los dedos de los pies. Si es necesario, administre una dosis de refuerzo (una quinta parte de la dosis original) del cóctel anestésico para restaurar el plano anestésico original.
NOTA: Tenga cuidado en este paso porque la mayor parte de la mortalidad observada a esta edad es causada por sobredosis anestésica. - Cubra los ojos del animal con un ungüento oftálmico protector para mantener los ojos húmedos durante la anestesia, suprimiendo el reflejo de parpadeo del animal.
- Para prevenir la hipotermia postanestésica, coloque el ratón con el cuello extendido sobre una almohadilla térmica durante todo el procedimiento hasta que esté totalmente despierto.
- Afeite la región postauricular izquierda con un cortaúñas y desinfecte con etanol al 70% y povidona yodada antes de la manipulación quirúrgica.
2. El procedimiento quirúrgico y la inyección de vectores
- Utilice un enfoque postauricular para exponer la bulla timpánica. Haga una incisión en el tejido subcutáneo con unas tijeras pequeñas para exponer el músculo postauricular. Después de retraer el tejido adiposo hacia el lado posterior de la incisión, separe los músculos de los lados derecho e izquierdo perpendiculares a la incisión para exponer el hueso temporal. Asegúrese de que esta incisión sea lo suficientemente larga para trabajar cómodamente con una visualización adecuada.
- Perfore la bulla timpánica con una aguja de 25 G y expanda el orificio según sea necesario con fórceps pelando el hueso hacia atrás para permitir el acceso a la vuelta basal de la cóclea, y luego ensanche lo suficiente como para visualizar la arteria estapedial y la membrana de la ventana redonda (RWM).
- Perfore el RWM suavemente en el centro con una pipeta capilar de borosilicato. Observe la salida de líquido a través del RWM en este punto; Esto es normal. Espere hasta que el flujo de salida se haya estabilizado (el líquido de salida de la cóclea se seca con un papel de filtro estéril).
NOTA: Tenga cuidado al sostener y avanzar la aguja de vidrio para que la perforación RWM sea lo más pequeña posible. Dependiendo del microscopio utilizado, sujete las pipetas con un micromanipulador o con la mano con un soporte para pipetas. - Prepare las pipetas para la inyección con un extractor de pipetas, de la misma manera que se preparan las pipetas de abrazadera de parche. Asegúrese de que el diámetro de la punta sea grande (aproximadamente 15 μm de diámetro) para que el pipeteo del virus hacia adentro y hacia afuera se realice fácilmente.
- Extraiga de 1 a 2 μl de virus adenoasociados (AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP o AAV2-GFP) en una pipeta de inyección. Después de estabilizar el flujo de salida (5 a 10 min), microinyecte este volumen fijo en el tímpano de la escala a través del mismo orificio previamente hecho en RWM.