Imágenes de bioluminiscencia in vivo de células progenitoras neurales humanas en un cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Weber, R. Z., et al., Trasplante intracerebral y seguimiento de bioluminiscencia in vivo de células progenitoras neurales humanas en el cerebro del ratón. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra el método para obtener imágenes de bioluminiscencia in vivo de células progenitoras neurales humanas modificadas genéticamente inyectadas en un cerebro de ratón. El proceso implica la inyección de luciferina, la preparación de imágenes y la detección de señales bioluminiscentes de las células trasplantadas en el lugar de la inyección.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

Obtención de imágenes in vivo

1. Preparación de luciferina
   1. Descongele la sal potásica de D-luciferina a temperatura ambiente (RT) y prepare una solución madre fresca de D-luciferina a 30 mg/ml en PBS.
   2. Esterilice la solución madre a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
      NOTA: Se recomienda el uso inmediato de la solución de trabajo. Si es necesario, la luciferina disuelta se puede almacenar a -20 °C. Sin embargo, el almacenamiento prolongado puede dar lugar a la degradación de la señal. La luciferina es un reactivo sensible a la luz; manténgalo alejado de la luz directa siempre que sea posible. También se pueden considerar sustratos alternativos, por ejemplo, cycluc, para mejorar el límite de resolución.
2. Imaging
   1. Initial setup
      NOTA: Las imágenes de bioluminiscencia se realizaron utilizando un sistema de imágenes in vivo (consulte la Tabla de materiales) que consta de una cámara oscura y una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) refrigerada.
      1. Haga doble clic en el icono del software Living Image y seleccione un ID de usuario en la lista desplegable.
      2. Haga clic en Inicializar en el panel de control que aparece. Una vez que se complete el proceso de inicialización, el cuadro de temperatura en el panel de control se volverá verde.
      3. En el panel de control, marque las casillas Luminiscente y Fotografía y seleccione Exposición automática (~60 s). Seleccione un campo de visión (se eligió D/12,5 cm para este protocolo). Introduzca la altura del sujeto (1,5 cm) y seleccione la opción Usar enfoque de altura del sujeto. Configure manualmente los siguientes parámetros: agrupación grande, f/2, filtro de excitación bloqueado y filtro de emisión abierto.
   2. Determine la cantidad inyectable de D-luciferina a 300 mg/kg de peso corporal.
      NOTA: La dosis estándar recomendada es de 150 mg/kg de D-luciferina. Este procedimiento se ajustó de acuerdo con un protocolo que reportó una mayor sensibilidad usando 300 mg/kg.
   3. Inyecte la luciferina por vía intraperitoneal (i.p.).
      NOTA: Si el animal necesita ser sedado antes de la inyección, tenga en cuenta que puede extender el tiempo máximo de expresión de luciferasa.
   4. Espere 5 minutos, luego anestesiar a los animales con un suministro continuo de isoflurano (4,5% en la fase de inducción y 1,5-2% en la fase de mantenimiento durante el procedimiento de imagen).
   5. Aplique lubricante oftálmico en los ojos, luego afeite a los animales sedados en la región de la cabeza con una afeitadora de cabello convencional. Coloque los animales en la cámara de imágenes y comience a obtener imágenes 15 minutos después de la inyección de luciferina haciendo clic en Adquirir en el panel de control.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Consumibles
Filtro de jeringa; 0,22 μm	TPP	99722
Equipo
Almohadilla			Producto de elección
Sistema de imágenes in vivo (IVIS Lumina III con paquete de software Living Imaging 4.2)	Perkin Elmer CLS136334
Vaporizador de isoflurano	Provet AG	330724
Productos farmacéuticos y reactivos
D-Luciferina Sal	de potasioPerkin Elmer	122799
Etanol; 70%			Producto de elección
Isoflurano (Isofluran (1-Cloro-2,2,2-trifluoretil-difluorometiléter) 99,9%)	Provet AG	Todos los productos farmacéuticos fueron suministrados por la farmacia cantonal, Zurich, Suiza
Lubricante optálmico (Retinol palmitat: 15.000 UI)	Bausch & Lomb Swiss AG	Todos los productos farmacéuticos fueron proporcionados por la farmacia cantonal de Zúrich, Suiza

térmica