Trasplante de células precursoras de interneuronas derivadas de humanos en el hipocampo de la cría de ratón

Abstract

Fuente: Gonzalez-Ramos, A., et. al., Trasplante de neuronas GABAérgicas derivadas de células madre humanas en el hipocampo de ratón posnatal temprano para mitigar los trastornos del neurodesarrollo. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra la inyección estereotáxica de células precursoras de interneuronas derivadas de humanos en el hipocampo de un cachorro de ratón modificado genéticamente con interneuronas inhibitorias reducidas, con el objetivo de restaurar el equilibrio excitatorio-inhibitorio.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Trasplante de células intrahipocampales

NOTA: Todos los pasos de esta sección se realizan fuera de la campana de cultivo celular en el animalario. El trasplante postnatal temprano de células en el cerebro se realizó en P2, considerando P0 el día del nacimiento.

1. Prepárese para el experimento de trasplante siguiendo los pasos a continuación.
   1. Autoclave todo el material quirúrgico o, si no es posible, esterilizar con otro método aprobado.
   2. Monte la jeringa de inyección en el soporte sin ningún capilar de vidrio. Enjuague la aguja con agua.
      NOTA: La aguja debe ser de 33 G.
   3. Curve 90° la punta de una aguja de insulina de 30 G.
   4. Cree una etapa casera similar a Play-Doh para colocar al cachorro con la cabeza plana (Figura 1A).
   5. Busque la jaula del ratón con la madre y los cachorros antes de preparar cualquier cosa para la cirugía para permitirles aclimatarse al nuevo entorno.
   6. Prepara una bandeja con hielo húmedo y una jaula vacía con un poco de papel para el isoflurano.
2. Anestesiar al cachorro de ratón.
   1. empape una hoja de papel con isoflurano (consulte la Tabla de materiales) y colóquela dentro de la jaula vacía. Tome con cuidado un cachorro y colóquelo en la jaula con el papel empapado en isoflurano.
      NOTA: Nunca deje menos de tres cachorros con la madre. No exceda los 20-30 s de anestesia con isoflurano, o el cachorro puede morir.
   2. Verifique el efecto de la anestesia mediante el cese del movimiento.
   3. Inmediatamente después de la anestesia, coloque al cachorro sobre un pañuelo húmedo sobre la superficie del hielo húmedo. Mantenga al animal en hielo durante 3 min hasta que las extremidades superiores se vuelvan blanquecinas (Figura 1B, flecha azul). Esto suele tardar entre 2 y 3 minutos.
   4. Utilice este tiempo para cargar la jeringa con la suspensión celular. Vuelva a suspender las células con cuidado con una pipeta antes.
   5. Coloque al cachorro en el marco estereotáxico. Use las barras para los oídos en la dirección opuesta (Figura 1A, flechas magenta).
      NOTA: La parte posterior de las barras para los oídos es menos puntiaguda y, como los cachorros P2 no tienen orejas, use el lado más plano para evitar lastimar al animal.
   6. Desde un lado, verifique si la cabeza está recta. La cabeza debe ser plana; use la etapa similar a Play-Doh para ajustarse a eso.
      NOTA: Los cachorros a esta edad aún no han abierto los ojos, por lo que no es necesario tomar medidas adicionales al respecto. Los cachorros no tienen pelaje a esta edad, por lo que no es necesario afeitar el área. No se administra ningún tratamiento específico para el dolor, ya que no es una incisión abierta en la piel y no se necesita sutura.
   7. Mantenga al cachorro cubierto con hielo (encima de papel de seda) durante toda la cirugía.
      NOTA: No coloque el hielo en contacto directo con la piel del cachorro.
3. Realice la inyección.
   1. Limpie la superficie de la piel con un pañuelo blando empapado en etanol.
   2. Identifique lambda y establezca las coordenadas en cero en la consola de visualización digital del instrumento estereotáxico (Figura 1C, línea discontinua amarilla). Las suturas sagitales y lambdoideas son fácilmente visibles a simple vista ya que están vascularizadas como líneas rojas.
      NOTA: Si tiene dificultades para visualizar lambda, coloque un pequeño trozo de hielo sobre la piel y espere un par de minutos para que se enfríe. Luego, retira el trozo de hielo, y el sutil blanqueamiento de la piel te permitirá visualizar.
   3. Vuelva a colocar la aguja de inyección en las coordenadas deseadas. En el protocolo descrito, la región objetivo era el hipocampo, y las coordenadas eran las siguientes: anteroposterior (AP) +0,85 y medio-lateral (ML) +1,35.
   4. Use una aguja de insulina doblada a 90 ° para penetrar el cráneo y crear un pequeño agujero.
   5. Baje la aguja de inyección hasta que haya cruzado el cráneo y ponga a cero las coordenadas dorso-ventrales (DV). Baje la aguja hasta que se obtengan las coordenadas DV deseadas. En el protocolo descrito, las coordenadas eran DV −1.1.
   6. Inyectar de acuerdo con los intervalos de tiempo predeterminados.
      NOTA: En el protocolo descrito, los tiempos exactos fueron los siguientes: (i) después de bajar a la coordenada DV, esperar 3 min, (ii) inyectar 1 μL de volumen durante 5 min, y (iii) después de inyectar todo el volumen, esperar 3 min.
   7. Retraiga la aguja lentamente.
4. Finaliza el procedimiento.
   NOTA: La cirugía no puede durar más de 15 min para asegurar la supervivencia del cachorro y evitar cualquier daño derivado de la anestesia por hipotermia.
   1. Calienta al cachorro con las manos hasta que comience a moverse antes de devolvérselo a la madre.
   2. Administre DOX a una concentración de 1 mg/ml en solución de sacarosa al 0,5% como agua potable durante al menos 2 días antes y 3 semanas después del trasplante (PT) para continuar la diferenciación celular in vivo.

Results

Figura 1: Trasplante tereotáxico S en crías de ratón recién nacidas en P2. (A) Se utiliza una etapa similar a Play-Doh para mantener el cuerpo del cachorro en posición y barras invertidas (flechas magenta). (<...

Materials