Transferencia de genes asistida por electroporación integrada en agarosa en progenitores de interneuronas corticales de ratón

Resumen

Fuente: Denaxa, M., el al., Trasplante de progenitores interneuronales corticales modificados quimiogenéticamente en cerebros de ratón posnatales tempranos. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra el procedimiento para inyectar un vector plásmido que lleva el gen de interés en progenitores interneuronales en un corte de cerebro embrionario, seguido de electroporación para la entrada de plásmidos y la expresión génica. Estos progenitores modificados se pueden usar más tarde para tratar trastornos cerebrales.

Protocolo

1. Inyecciones focales de ADN
   1. Prepare una mezcla de ácido desoxirribonucleico (ADN) de vectores de expresión: pCAGGs-IRES-GFP (vector de control) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, a una concentración de 1 μg/μL para cada vector. Agregue una solución verde rápida (caldo de 25 mg / ml) en una dilución de 1/10.
   2. Llene una micropipeta de vidrio estirado (0,5 mm de diámetro interior y 1 mm de diámetro exterior) con 10 μL de la mezcla de ADN e inyecte pequeñas cantidades (en el rango de 25-50 nL) en la región seleccionada (eminencia ganglionar medial o MGE/ganglionares caudal o CGE) del corte (Figura 1 y Figura 2).
2. Electroporación aguda
   NOTA: La electroporación debe realizarse inmediatamente después de la inyección focal de ADN.
   1. Coloque el pequeño bloque de agarosa en el electrodo de la placa de Petri y fije la columna de agarosa al electrodo de la cubierta móvil con una microespátula de punta plana.
   2. Transfiera la rebanada con su membrana de soporte al bloque de agarosa y coloque el electrodo superior con la columna de agarosa en la parte superior de la región seleccionada (MGE / CGE) de la rebanada.
      NOTA: Los voltajes de carga de 125 V (dos pulsos de 5 ms cada uno, intervalo de 500 ms) producirán una electroporación exitosa (Figura 3).
3. Después de la electroporación, coloque la rebanada con su membrana de soporte en la placa y transfiérala a una incubadora de cultivo de tejidos de CO₂ a 37 °C.

Resultados

Figura 1: Cortes teleencefálicos representativos utilizados para experimentos de electroporación aguda. (A-C) Se obtuvieron cortes teleencefálicos en tres niveles rostrocaudales secuenciales distintos, teñidos con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). LGE: emine...

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