Transferencia de genes asistida por electroporación integrada en agarosa en progenitores de interneuronas corticales de ratón

1. Inyecciones focales de ADN
   1. Prepare una mezcla de ácido desoxirribonucleico (ADN) de vectores de expresión: pCAGGs-IRES-GFP (vector de control) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, a una concentración de 1 μg/μL para cada vector. Agregue una solución verde rápida (caldo de 25 mg / ml) en una dilución de 1/10.
   2. Llene una micropipeta de vidrio estirado (0,5 mm de diámetro interior y 1 mm de diámetro exterior) con 10 μL de la mezcla de ADN e inyecte pequeñas cantidades (en el rango de 25-50 nL) en la región seleccionada (eminencia ganglionar medial o MGE/ganglionares caudal o CGE) del corte (Figura 1 y Figura 2).
2. Electroporación aguda
   NOTA: La electroporación debe realizarse inmediatamente después de la inyección focal de ADN.
   1. Coloque el pequeño bloque de agarosa en el electrodo de la placa de Petri y fije la columna de agarosa al electrodo de la cubierta móvil con una microespátula de punta plana.
   2. Transfiera la rebanada con su membrana de soporte al bloque de agarosa y coloque el electrodo superior con la columna de agarosa en la parte superior de la región seleccionada (MGE / CGE) de la rebanada.
      NOTA: Los voltajes de carga de 125 V (dos pulsos de 5 ms cada uno, intervalo de 500 ms) producirán una electroporación exitosa (Figura 3).
3. Después de la electroporación, coloque la rebanada con su membrana de soporte en la placa y transfiérala a una incubadora de cultivo de tejidos de CO₂ a 37 °C.

Figura 1: Cortes teleencefálicos representativos utilizados para experimentos de electroporación aguda. (A-C) Se obtuvieron cortes teleencefálicos en tres niveles rostrocaudales secuenciales distintos, teñidos con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). LGE: eminencia ganglionar lateral; MGE: eminencia ganglionar medial; CGE: eminencia ganglionar caudal. Barras de escala = 200 μm. Los asteriscos amarillos indican el sitio de electroporación en cada corte. La línea blanca marca el borde de la eminencia ganglionar.

Figura 2: Representación esquemática del flujo de trabajo experimental. (A) Los cortes de cerebro de ratón se electroporan con construcciones apropiadas, y (B) después de 12 h, se aíslan los precursores de interneuronas corticales (CI) modificados y (C) se trasplantan en el palio de crías de ratón recién nacidas (P0-P2). Con el fin de modificar la actividad de los IC inmaduros, las crías P14 que habían recibido trasplantes celulares fueron inyectadas con CNO o vehículo durante cuatro días constitutivos de acuerdo con el protocolo presentado. (A') Fotografía de la configuración de electroporación aguda de corte de cerebro de ratón.

Figura 3: Experimento representativo exitoso de electroporación de corte agudo. (A) Sección coronal representativa de un cerebro embrionario E14.5 transfectado en el CGE con plásmidos pCAGGs-IRES-GFP (proteína fluorescente verde) y pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (proteína fluorescente roja) y cultivado durante 12 h. La sección ha sido inmunoteñida para GFP (A, B, C) y RFP (A, B, D). El área en caja en el panel A se amplía para mostrar la expresión de los reporteros fluorescentes (B), GFP (C) y RFP solo (D). La línea blanca marca el borde de la eminencia ganglionar. B-D: misma foto, diferentes canales o una combinación de los dos canales diferentes. Barras de escala = 200 μm (A), 100 μm (B-D).