Inyección de vectores adenoasociados recombinantes en un modelo de ratón con atrofia muscular espinal y bulbar

Resumen

Fuente:
Pourshafie, N., et al. Administración sistémica de microARN utilizando virus adenoasociados recombinantes serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores. J. Vis. Exp. (2018).

En este video, un ratón afectado por atrofia muscular espinal y bulbar o SBMA se somete a una inyección en la vena de la cola de vectores AAV (vectores adenoasociados) recombinantes que llevan un plásmido que codifica microARN terapéutico. El vector produce microARN que se une al AR-ARN mutante (receptor de andrógenos) (ácido ribonucleico mensajero), desencadenando su degradación. Esto reduce la acumulación de proteínas tóxicas y ayuda a mejorar la función neuromuscular.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Inyección en la vena de la cola del plásmido AAV-miRNA

NOTA: Este paso necesita ajustes de acuerdo con el gen diana y la edad y el peso de los ratones. Utilice las pautas del Comité Institucional y de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) para determinar el rango de dosis, el volumen y la mejor vía de administración en función de la edad y el peso de los ratones. Se espera que la señal de fluorescencia de GFP (proteína fluorescente verde) y los niveles de expresión de miARN en los tejidos diana alcancen su punto máximo a partir de las 2 semanas posteriores a la inyección. El siguiente protocolo se refiere a ratones machos en la edad adulta temprana. El AAV debe manejarse como un riesgo biológico según las pautas del Nivel 1 de Bioseguridad.

1. Divida el stock de plásmidos AAV-miRNA en alícuotas de 100-200 μL que contengan una carga viral de 10^{10-10 11} genomas virales por ml (vg/mL) utilizando solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Se debe utilizar equipo de protección personal contra riesgos biológicos de laboratorio para manipular la solución AAV.
   NOTA: Una vez que se descongela una alícuota, se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de dos semanas. El caldo viral se puede almacenar en un congelador a -80 °C.
2. Sujete al ratón en inmovilizadores disponibles comercialmente, como tubos de plástico o de película de plástico cónicos del tamaño adecuado.
3. Limpie la superficie de la cola con toallitas con alcohol al 70%.
4. Sostenga una almohadilla tibia (28-30 ° C) debajo de la cola durante 30 segundos para aumentar la vasodilatación. Alternativamente, caliente a los animales con una lámpara de calor roja (a una distancia de 2-3 pies) o sumergiendo la cola en agua tibia.
5. Comenzando desde la porción distal de la cola, inserte la aguja (27-30 G) cargada con la alícuota viral, biselada hacia arriba, 15 ° desde la cola, en la vena. Antes de la inyección, asegúrese de que la aguja esté insertada correctamente.
   1. Si se siente resistencia durante la inyección o aparece hinchazón debajo de la piel, detenga el procedimiento. Retire la aguja y vuelva a insertarla por encima del sitio de inyección anterior.
      NOTA: Alternativamente, esto se puede lograr aspirando suavemente la aguja y observando la sangre. La aspiración fuerte puede colapsar la vena de la cola. Si la vena palidece durante la inyección, la aguja se inserta correctamente.
6. Una vez completada la inyección, espere unos segundos antes de levantar la aguja.
7. Observe el lugar de la inyección para detectar sangrado. Aplique una presión moderada con dos dedos en el sitio hasta que se detenga el sangrado.
8. Regrese al animal a su jaula.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
	USA Scientific	1615-5500
Lactate Ringer's Solución	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vórtice	Centrífuga de	128101
	Eppendorf	22624415
Película de laboratorio	Jeringa Bemis	PM996
1 ml	BD	309626	Viene con una aguja de 25g adjunta. Reemplace con una aguja de 27-30g para inyección
Aguja de 30g	BD	305106
Isoflurano	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurano USP 250 mL
Mascarilla de anestesia	Kopf Instruments	906
Gasa	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Puntas de pipeta	USA Scientific	1111-0816
Micropipeta	Gilson	4642080
Vaporizador de anestesia con gas	SurgiVet	4214322	Classic T3
Eliminador de anestesia con gas	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Almohadilla de banco	Sears	17280
VWR		56617-006
Rotarod	Panlab/ Harvard Apparatus	76-0772	4 ratas/ 4 ratones
70% etanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 prueba
70% Isopropanol	VWR	89108-160

Tubo de microcentrífuga de Fisher Scientificde Almohadilla térmica