Inyección intracraneal de metabolitos microbianos derivados del intestino en un modelo de ratón

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Preparación para el animal de experimentación

1. Obtenga ratones machos C57BL / 6JNarl de tipo salvaje de 6-8 semanas de edad de un proveedor.
2. Aloje a los ratones en una jaula de ratones estándar con comida estándar para ratones y agua esterilizada ad libitum.
   NOTA: Las condiciones de alojamiento para el Centro de Animales de Laboratorio son de 22 ± 1 °C de temperatura, 55% ± 10% de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 13 h/11 h.

2. Cirugía estereotáxica

1. Prepare y esterilice el instrumento estereotáxico, los instrumentos quirúrgicos y los artículos relacionados.
   NOTA: Todos los artículos que entrarán en contacto directo con el sitio quirúrgico deben esterilizarse para evitar infecciones.
2. Anestesiar al ratón colocándolo en la jaula de plexiglás con isoflurano al 1% -5% en oxígeno.
   NOTA: Observe de cerca al ratón para asegurarse de que la frecuencia respiratoria se mantenga en alrededor de una respiración por segundo.
3. Saque el ratón de la cámara de anestesia. Afeite el sitio quirúrgico (cabeza del ratón) con una recortadora de mascotas. Coloque el ratón en el marco estereotáxico fijando los incisivos del ratón en la barra de incisivos en el soporte de los incisivos estereotáxicos. Cubra la nariz con la mascarilla nasal.
4. Anestesiar al ratón con isoflurano al 1%-2,5% en oxígeno durante toda la cirugía estereotáxica. Evalúe la nocicepción del ratón a través del reflejo de pellizco del dedo del pie y asegure una frecuencia respiratoria constante antes de incidir en el sitio quirúrgico.
5. Coloque una almohadilla térmica (37,0 °C) debajo del mouse en el marco estereotáxico para mantener la temperatura corporal durante la cirugía. Alternativamente, mantenga la temperatura central con la ayuda de una sonda térmica rectal que conecte el calentador programado y la almohadilla térmica.
6. Retire el pelaje recortado de la cabeza con cinta adhesiva. Inyecte al ratón con el analgésico Ketoprofeno (5 mg / kg) por vía subcutánea para aliviar el dolor. Aplique ungüento para los ojos para evitar la sequedad ocular.
7. Inserte la barra de oído puntiaguda en el canal auditivo para fijar la cabeza.
8. Centre la cabeza ajustando la escala de la barra para los oídos.
9. Apriete la pinza nasal en el soporte del incisivo para evitar el movimiento vertical. Presione la cabeza suavemente para verificar que la cabeza esté fija y evitar que la cabeza se afloje durante la cirugía posterior.
10. Desinfecte el cuero cabelludo con tres exfoliantes alternos de clorhexidina con un hisopo de algodón. Comience cada exfoliante desde el medio hacia el lado exterior (desde el área central más desinfectada hasta el área menos desinfectada).
    NOTA: El uso de exfoliantes desde el medio hacia el exterior podría ayudar a los científicos a minimizar la infección y la contaminación del pelaje. El área exterior está cerca de la región de la cabeza sin afeitar, que todavía tiene una gran cantidad de pelo y no es fácil de desinfectar a fondo.
11. Incidir el cuero cabelludo de manera anterior/posterior (<1 cm) con una cuchilla quirúrgica. abra la incisión y limpie el cráneo un hisopo de algodón sostenido por pinzas microdisección.
    NOTA: Las pinzas de microdisección, la cuchilla quirúrgica y los hisopos de algodón deben esterilizarse en autoclave antes de la cirugía. Durante el proceso quirúrgico, esterilizar todo el equipo quirúrgico con un esterilizador de perlas de vidrio (150 °C) durante al menos 5 s antes y después de cada animal. Prepare un vaso de precipitados esterilizado para sujetar la cuchilla quirúrgica y las pinzas durante el proceso quirúrgico y entre los animales.
12. Identifica el Bregma y Lambda en el cráneo. Utilice el Bregma como referencia para localizar la región de interés.
    1. Opcional: Monte el taladro estereotáxico en el soporte del taladro estereotáxico y use la punta del taladro para apuntar Bregma como referencia. Esterilice el taladro estereotáxico con el esterilizador de perlas de vidrio (150 °C) durante al menos 5 s.
13. Calibre y alinee el plano horizontal plano del cráneo en los planos izquierdo / derecho y anterior / posterior mediante Bregma / Lambda.
    NOTA: Si no está en un plano horizontal correcto, vuelva a montar el mouse en el instrumento estereotáxico.

3. Implantación de cánula guía personalizada comercial

1. Identifique y etiquete la posición del ventrículo lateral derecho en función de las coordenadas estereotáxicas: Distancia al bregma, anterior/posterior (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm.
   NOTA: Las coordenadas se pueden modificar en función de la región de interés. Las coordenadas para el ventrículo lateral se basaron en ratones adultos C57BL / 6J con un rango de peso de 26-30 g.
2. Taladre un orificio (diámetro = 1,5 mm) a través del cráneo en el sitio marcado con un taladro estereotáxico para la implantación de una cánula guía comercial.
3. Taladre de dos a cuatro orificios más (diámetro = 1,5 mm) en el cráneo con un taladro estereotáxico para el montaje de tornillos de acero inoxidable.
   NOTA: Esterilice el taladro estereotáxico con un esterilizador de perlas de vidrio (150 °C) durante al menos 5 s antes y después de cada animal.
4. Limpie los restos de hueso y deje de sangrar con un hisopo de algodón.
5. Limpie el cráneo con lidocaína (1 mg / kg) con un hisopo de algodón para obtener efectos anestésicos locales, antipruriginosos y analgésicos. Si el sangrado no se detiene después de perforar, coloque suavemente un hisopo de algodón en el orificio para la hemostasia.
6. Monte de dos a cuatro tornillos de acero inoxidable en los orificios para proporcionar anclajes para acrílico dental.
7. Coloque la cánula guía comercial en el soporte de la cánula estereotáxica y desinféctela con el esterilizador de perlas de vidrio (150 °C).
   NOTA: La cánula guía comercial, el maniquí comercial y el inyector comercial (Figura 1A) se personalizaron con las especificaciones que se muestran en la Tabla de Materiales.
8. Mueva el soporte de la cánula estereotáxica al orificio perforado para el ventrículo lateral e inserte lentamente la cánula guía comercial en el orificio hasta la profundidad deseada (2,5 mm).
   NOTA: La coordenada dorsal/ventral se puede definir estableciendo la punta de la cánula guía comercial como referencia cuando la punta apenas se inserta en el orificio.
9. Aplique 10 μL de adhesivo de cianoacrilato de n-butilo (pegamento adhesivo para tejidos) para fijar la cánula guía comercial en el orificio perforado y espere 3-4 min. Suelte suavemente la cánula guía comercial del soporte de la cánula estereotáxica y aleje el soporte.
10. Aplique el acrílico dental en el cuero cabelludo inciso para fijar la cánula guía comercial y espere al menos 5 min. Implante el maniquí comercial en la cánula guía comercial para evitar que la cánula se obstruya con sangre o fluidos corporales (Figura 1B).
11. Suelte la barra del canal auditivo y retire el mouse del marco estereotáxico.
12. Coloque el ratón en una nueva jaula con una almohadilla térmica debajo para recuperarse de la anestesia y observe continuamente hasta que el ratón se despierte por completo.
    NOTA: No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Un animal que se ha sometido a una cirugía no debe regresar a la compañía de otros animales hasta que se recupere por completo.
13. Devuelva el ratón a un solo alojamiento o alojamiento grupal, según el protocolo del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y el diseño experimental. Para el alojamiento en grupo, asegúrese de que haya menos ratones alojados en una jaula para minimizar las lesiones no deseadas o el desprendimiento de la cánula.
14. Administre ibuprofeno (0,2 mg/ml) en el agua potable durante al menos 3 días para el cuidado posoperatorio y controle dos veces al día para detectar signos de dolor y angustia durante al menos 3 días.
    1. Durante el cuidado postoperatorio, aplique ungüento de roxitromicina alrededor de la piel para prevenir la inflamación y la infección en los ratones.
    2. Mantenga el control del estado del animal y administre una inyección intraperitoneal oportuna de glucosa al 5% y/o cloruro de sodio al 0,9% para proporcionar suficiente energía.
    3. Si el estado de dolor, angustia o infección se deteriora constantemente, eutanasia al ratón por inhalación de CO₂.
15. Espere 1 semana después de la operación para que el ratón esté listo para la administración intracerebroventricular de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) y las pruebas de comportamiento.

4. Preparación de AGCC

1. Disuelva el acetato de sodio, el butirato de sodio y el propionato de sodio en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (consulte la Tabla de materiales).
2. Asegúrese de que los productos químicos estén completamente disueltos, luego ajuste el pH a 7.4 y filtre la mezcla de AGCC a través de un filtro de 0.22 μm para esterilización.

5. Configure el sistema de infusión para la administración intracerebroventricular de AGCC durante las pruebas de comportamiento

1. Monte una cámara de techo para registrar el comportamiento. Conecte la cámara a un ordenador para controlar el software de grabación de vídeo (Figura 2).
2. Llene una jeringa de 10 μL con agua destilada.
   NOTA: Evite las burbujas de aire en la jeringa de microlitros.
3. Conecte una bomba de microinyección con el controlador de microinyección.
4. Monte la jeringa de microlitros en la bomba de microinyección. Para instalar la jeringa, presione el botón para aflojar la abrazadera e instale la jeringa en la posición correspondiente. Cierre la abrazadera y apriete el tornillo de retención del émbolo de la bomba de microinyección (Figura 3A).
5. Inserte el inyector comercial en el tubo de polietileno (Figura 1A).
6. Cuelgue el tubo de polietileno en la cámara del techo sobre la pista de pruebas.
7. Llene el tubo de polietileno con agua destilada con una jeringa de insulina. Conecte la jeringa de microlitros al tubo de polietileno colgante.
   NOTA: Asegúrese de que el tubo de polietileno sea lo suficientemente largo como para permitir que el mouse se mueva libremente por el campo de pruebas.

6. Configuración del sistema del controlador de microinyección

1. Encienda el controlador de microinyección y presione Mostrar todos los canales para acceder a la pantalla de comando (Figura 3C). Presione Configuración y establezca el Objetivo de volumen en 9.800 nL con la Tasa de entrega en 100 nL/s. Infunda 9,800 nL de agua destilada del tubo de polietileno conectado a la jeringa de microlitros (presione Dirección para cambiar al modo Infundir y presione EJECUTAR) (vea los cuadrados rojos en la pantalla Comando de la Figura 3C).
2. Presione Configuración y establezca el Objetivo de volumen en 3,000 nL con una tasa de entrega de 100 nL / s. Retire 3,000 nL de aceite mineral (presione Dirección para cambiar al modo de retiro y presione RUN) (consulte los cuadrados rojos en la pantalla de comando de la Figura 3C).
   NOTA: Se debe observar una clara separación de fases de aceite y agua en el tubo de polietileno.
3. Desmonte el tubo de polietileno de la aguja de la jeringa de microlitros. Escupe 3,000 nL de agua destilada de la aguja de la jeringa de microlitros (presione Direction para cambiar al modo Infuse y presione RUN).
4. Vuelva a insertar la jeringa de microlitros en el tubo de polietileno. Presione Configuración y establezca el Objetivo de volumen en 9.500 nL con una velocidad de entrega de 100 nL/s. Retire 9.500 nL de SCFA (presione Dirección para cambiar al modo Retirar y presione EJECUTAR). Etiquete la fase de AGCC de aceite para validar si los AGCC se infunden correctamente.
5. Presione Configuración y establezca el objetivo de volumen deseado con velocidad de entrega en 7 nL / s. Presione Dirección para cambiar al modo de infusión (consulte los cuadrados rojos en la pantalla de comando de la Figura 3C).
   NOTA: Determine el volumen según el tiempo de infusión. Por ejemplo, si el tiempo de infusión es de 3 min para la velocidad de administración de 7 nL/s, volumen objetivo = 1,260 nL.
6. Presione RUN para infundir la jeringa de microlitros hacia adelante hasta que el líquido salga por el extremo frontal del inyector comercial antes de insertar el inyector en la cánula para la inyección de AGCC.

7. Infusión de AGCC en el ventrículo lateral a través de la cánula guía comercial en un ratón que se mueve libremente

1. Anestesiar al ratón colocándolo en la jaula de plexiglás con isoflurano al 1% -5% en oxígeno.
   NOTA: Observe de cerca al ratón para asegurarse de que la frecuencia respiratoria se mantenga en alrededor de una respiración por segundo.
2. Limpie el mouse e inserte el inyector comercial en la cánula guía comercial (Figura 3B).
   NOTA: Si la cánula guía comercial está obstruida por sangre o líquido corporal, desobstruya suavemente con pinzas.
3. Deje que el ratón se recupere de la anestesia durante 15 minutos en una jaula antes de realizar pruebas de comportamiento.
4. Para la prueba básica de locomoción, coloque al ratón en una jaula novedosa y déjelo explorar libremente durante 35 minutos. Infunda AGCC utilizando una tasa de administración de 7 nL / s para un volumen objetivo de 2,100 nL en los primeros 5 minutos (presione Dirección al modo Infundir y presione RUN).
   NOTA: La locomoción en la nueva jaula se puede analizar utilizando un software de seguimiento de video de comportamiento animal.
5. Anestesiar el ratón (repitiendo el paso 7.1) y retirar el inyector comercial de la cánula guía comercial.
   NOTA: El ratón puede ser inyectado repetidamente con diferentes controles/metabolitos después de dar el tiempo adecuado para lavar la inyección anterior. Siempre que la cánula esté fijada en la cabeza del ratón, el ratón puede probarse repetidamente con diferentes metabolitos.

8. Restauración del sistema de microinyección

1. Desmonte el tubo de polietileno de la jeringa de microlitros.
2. Inyecte aire en el tubo con la jeringa de insulina para desechar el agua destilada en el tubo de polietileno. Vacíe la jeringa de microlitros.
3. Presione Restablecer posición en la pantalla Configuración para abrir la pantalla de definición de figura de parada de jeringa (Figura 3C).
4. Presione Retirar hasta que se produzca un pitido para restablecer la bomba de microinyección a la posición completamente retirada (Figura 3C).
5. Regrese a la pantalla de comandos y apague el controlador de microinyección si hay un signo **END REACHED** en esta pantalla (Figura 3C).

Figura 1: Implantación de la cánula guía comercial en ratones. (A) La imagen representativa de una cánula, maniquí e inyector de guía comercial. (B) La imagen representativa de una cánula guía comercial y un maniquí implantados en el cerebro de ratones por fijación con acrílico dental.

Figura 2: El equipo de infusión intracerebroventricular para pruebas de comportamiento. El diagrama del sistema de microinyección, el sistema de grabación de video y el aparato de comportamiento. Abreviatura: AGCC = ácidos grasos de cadena corta.

Figura 3: El sistema de microinyección. (A) La instalación de la jeringa de microlitros mediante una bomba de microinyección. (B) La inserción del inyector comercial conectado con un tubo de polietileno en la cánula guía comercial (C). La pantalla táctil del controlador de microinyección.