Conductos sembrados con células de Schwann para la regeneración axonal después de una lesión de la médula espinal

En este artículo

Resumen

Fuente: Lee, Y., et.al. Trasplante de células de Schwann dentro de conductos de PVDF-TrFE para puentear muñones de médula espinal de rata seccionados para promover la regeneración de axones a través de la brecha. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el uso de un conducto de polímero piezoeléctrico sembrado con células de Schwann para promover la regeneración de axones en una médula espinal de rata seccionada. El conducto proporciona orientación estructural, mientras que sus propiedades bioeléctricas estimulan el crecimiento de neuritas. Las células de Schwann dentro del conducto secretan factores neurotróficos, lo que apoya el puente axonal entre los muñones rostral y caudal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Transección en T8

Coloque el retractor alrededor de T7 a T9. Una vez que se hayan eliminado todas las láminas, asegúrese de que los espacios entre los procesos transversales sean visibles, especialmente en T8. También examine los huesos a lo largo de ambos lados entre T7 y T9 para asegurarse de que no haya fragmentos óseos que sobresalgan hacia afuera.
NOTA: Este espacio en T8 es importante para realizar la transección completa. Las vértebras a lo largo de la longitud deben retirarse para facilitar la inserción del conducto.
Corta las raíces dorsales y ventrales por encima y por debajo de T8 con unas tijeras de resorte en ángulo. Agregue solución salina a la médula espinal y espere a que la sangre se coagule.
NOTA: Este paso es importante para la inserción adecuada del conducto.
Coloque las tijeras de resorte en ángulo sobre la médula espinal en los espacios entre los procesos transversales en T8 y haga un corte para cortar completamente la médula espinal. Coloque un pequeño trozo de espuma comprimida en el espacio resultante de 2-2,5 mm y agregue solución salina al área inmediatamente.

2. Inserción de conductos

Mientras espera que los muñones del cordón cortados alcancen la hemostasia, saque un conducto de 1x PBS. Corta los triángulos de absorción en trozos finos y largos y colócalos en el conducto para eliminar el exceso de PBS. Compruebe que las ventanas precortadas estén abiertas.
Elimine la solución salina y la sangre usando trozos largos y delgados de triángulos de absorción. Levante los dos muñones de la médula espinal con una microespátula para asegurar una buena separación. Levante suavemente el muñón rostral con la microespátula y deslice el conducto sobre el muñón con las ventanas hacia uno mismo. Asegúrese de que todo el muñón esté insertado y que no haya sangrado excesivo en el conducto.
Levante suavemente el muñón caudal y deslice el otro extremo del conducto sobre el muñón. Asegúrese de que todo el muñón esté insertado y que las ventanas estén en la superficie dorsal (Figura 1A).

3. Preparación e inyección de células de Schwann (SC) / matriz inyectable

Mientras espera que el cordón cortado alcance la hemostasia, retire el medio por encima del gránulo GFP-SC. Vuelva a suspender las GFP-SC en 10 μl de DMEM/F12 frío. Agregue 10 μl de gel inyectable en frío a la suspensión celular y mezcle bien mediante pipeteo repetido. Mantenga la mezcla de GFP-SC/DMEM/F12/matriz inyectable en hielo hasta que se complete la inserción del conducto.
Después de asegurarse de que las ventanas de la superficie dorsal están abiertas (Figura 1A), inyecte 20 μl de la mezcla GFP-SC/DMEM/F12/matriz inyectable en el conducto a través de una de las ventanas precortadas utilizando una punta de carga Western blot y una micropipeta. Si la mezcla de matriz SC/DMEM/F12/inyectable debe llenar demasiado el conducto, elimine el exceso con triángulos de absorción. Cierre las ventanas después de la inyección; no es necesaria la sutura (Figura 1B).

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Resultados

Figura 1: Ventana que se cierra después de la inyección SC/DMEM/F12/matrix. Las ventanas se abren doblando hacia atrás cada solapa después de colocar el conducto entre los muñones rostral y caudal (A). Las ventanas se cierran de...