Espectroscopia Raman anti-Stokes coherente para visualizar neuronas mielinizadas en tejido cerebral de ratón

Resumen

Fuente: McCullagh, E. A., et al. Aplicación coherente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para obtener imágenes de mielinización en cortes cerebrales. J. Vis. Exp. (2022)

El video demuestra imágenes de fluorescencia y espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS) para visualizar la arquitectura neuronal en el tejido cerebral de los roedores. La tinción de Nissl marca los cuerpos celulares uniéndose al ARN ribosómico, mientras que las imágenes de CARS se dirigen a la mielina rica en lípidos a través de señales inducidas por láser. La superposición de las imágenes de fluorescencia y CARS proporciona una vista detallada de los cuerpos celulares y los axones mielinizados.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal correspondiente.

1.

1. Tinción Secciones flotantes sin tinción para Nissl, para visualizar cuerpos celulares (1:100), en medios de anticuerpos (medios AB: tampón de fosfato 0,1 M (PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, albúmina sérica bovina al 1% (BSA)) durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio estándar.
   1. Proteja las secciones de la luz con papel de aluminio y/o una cubierta. Las longitudes de onda de 550 nm o menos son compatibles con las imágenes CARS (Figura 1).
      NOTA: Si bien no esperamos que Triton-X u otros reactivos tengan un impacto en las imágenes CARS de lípidos, es posible que se justifiquen controles adicionales con medios de anticuerpos específicos.
2. PUNTO DE PAUSA: Almacene las secciones flotantes (mientras están protegidas de la luz) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta la obtención de imágenes. Una vez seccionado, obtenga imágenes de secciones cerebrales dentro de las 2 semanas.

2. NOTA de imagen

: La configuración del láser CARS contiene un láser de fibra que proporciona el reloj de 80 MHz y un láser OPO (oscilador paramétrico óptico) con un rango sintonizable de 770-990 nm con el haz de Stokes fijado a 1031 nm, que son necesarios para recopilar la señal CARS. Hay una abertura para ambos haces.

1. Antes de llevar las muestras al microscopio, encienda y caliente el láser CARS durante al menos 1 h, alinee el láser CARS y Koehler la óptica del condensador y el diafragma del microscopio para obtener imágenes CARS directas.NOTA: Este paso es fundamental para el correcto funcionamiento de la microscopía CARS.
   1. Para la alineación espacial de los dos rayos láser (pump y stokes), acceda a los dos PSD internos (detectores sensibles a la posición) a través de la GUI láser CARS (interfaz gráfica de usuario).
   2. Logre la alineación temporal utilizando la función de retardo en la GUI láser CARS, que puede ayudar a superponer los pulsos de los dos láseres (pump y stokes) que tienen diferentes dispersiones debido a sus diferentes longitudes de onda. Por lo tanto, tanto la superposición temporal como espacial de los haces de la bomba y los stokes se realiza con la entrada del usuario a través de la GUI.
   3. Ajuste el periscopio externo (los dos últimos espejos de la configuración) para centrar los dos láseres superpuestos espacialmente en los espejos del cabezal de escaneo del microscopio.
   4. Para una mejor detección directa de CARS no escaneados, asegúrese de que el condensador esté Koehler (lo que significa que el condensador está centrado y enfocado en el diafragma para lograr una iluminación uniforme)
2. Para imágenes confocales de inmunofluorescencia e imágenes CARS, instale el láser CARS, con detectores no escaneados (NDD) directos y epi CARS, incorporando un microscopio confocal equipado con láseres visibles para imágenes de fluorescencia (Figura 2).
3. Coloque las secciones en una placa de cultivo con cubreobjetos (para microscopía invertida), PBS para evitar que el tejido se seque y un peso de vidrio para mantener el tejido cerca del cubreobjetos.
4. Tome pilas en z o imágenes individuales con un objetivo de agua corregido por infrarrojos de 60X y apertura numérica (NA) de 1,2 grados, que sirve para la recopilación de la señal CARS en la dirección epi y a través de un condensador de 0,55 NA en la dirección hacia adelante para obtener imágenes de áreas cerebrales como el núcleo medial del cuerpo trapezoidal (MNTB).
   1. Tome las imágenes de CARS a aproximadamente 600 mW de bomba/sonda y 300 mW Stokes, utilizando la GUI láser de CARS. Estos valores de potencia láser son medidos internamente por el sistema. Las potencias de ambos láseres en la ubicación de la muestra son inferiores a 25 mW y son seguras para la muestra de tejido.
   2. Superponga la bomba y los haces de Stokes espacial y temporalmente. Ajuste el OPO a 797,2 nm. Esto produce una longitud de onda CARS de 650 nm. Debido al mayor nivel de energía, el retorno resultante al estado fundamental es anti-Stokes (desplazamiento al azul) a la excitación.
   3. Capture la señal CARS en detectores epi o directos no escaneados utilizando filtros de paso de banda (640-680 nm) seguido de la detección secuencial de la etiqueta de inmunofluorescencia (en este caso, Nissl marcado con fluorescencia). nota: El marcador de soma neuronal de Nissl no queda atrapado en el filtro de paso de banda CARS de 640-680 nm, lo que permite la combinación de fluorescencia e imágenes CARS en las imágenes que se presentan a continuación.
   4. El CARS y la fluorescencia no comparten PMT. Utilice estos ajustes para obtener una señal lipídica óptima para obtener imágenes selectivas de mielinización en el área del cerebro. cautela: Proteja al usuario del rayo láser
5. Guarde las imágenes como archivos .oib, que se pueden importar a un programa de análisis de imágenes para una mayor cuantificación (Figura 3).

Resultados

Figura 1: Las imágenes CARS se pueden combinar con imágenes inmunofluorescentes. Los gráficos muestran que las imágenes de CARS ocurren en un espectro de señal roja de 660/640 nm. Esta longitud de onda está lo suficientemente alejada del ran...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tinción:
AB Medios:			1n 1.000 ml de fosfato de H2O de Millipore
tamponado (PB):
fosfato de potasio Monobase	Sigma	P5655
Fosodio de sodio Dibasic	Sigma	S7907
BSA (Albúmina de suero bovino)	Sigma life science	A2153-100g
Cloruro de sodio	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
Láser picoesmeralda APE	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
(420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100M-2P
(500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
paso de banda filtros (640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Microscopio confocal	Olympus	FV1000
Pipeta de transferencia de corte	Fisher	13-711-7M
dicroico de paso largo 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
dicroico de paso largo 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
dicroico de paso corto de 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
	MatTek	P35G-0-10-C
peso de vidrio (varilla de boro de 10 mm x 10 mm)	Allen Scientific Glass Inc
680 nm	Tecnología Chroma	ET680sp-2p8
PBS

Filtro de paso de banda Filtro de paso de banda de placa de cultivo de fondo de vidrio Filtro de emisión de paso corto multifotónico