Imágenes de la dinámica del calcio en las células ciliadas de la línea lateral de las larvas de pez cebra

Resumen

Fuente: Lukasz, D., et al. Imágenes de calcio in vivo de células ciliadas de la línea lateral en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra imágenes en vivo de la afluencia de calcio en las células ciliadas de la línea lateral de una larva de pez cebra transgénica paralizada utilizando un microscopio confocal. La estimulación mecánica de los mechones de cabello a través de pulsos de fluido induce la entrada de calcio a través de canales de mecanotransducción y canales dependientes de voltaje, que se visualiza en tiempo real mediante indicadores de fluorescencia. El método destaca la dinámica del calcio apical y basal en las células ciliadas del neuromastilo, dilucidando su papel en la detección del movimiento del agua.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Fijación e inmovilización de larvas en la cámara de imágenes
   1. Bañe una larva Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) en aproximadamente 1 ml de tampón de tampón embrionario (E3) que contenga 0,04% de MS-222 durante 1–2 min en la superficie encapsulante de silicona de la cámara de imágenes hasta que la larva se vuelva inmóvil o no responda al tacto.
      1. Bajo un microscopio estereoscópico, coloque la larva en el centro de la cámara de perfusión de modo que quede plana de lado contra el encapsulante de silicona.
         NOTA: Para mantener la consistencia, siempre monte las larvas en el mismo lado (p. ej., con el lado derecho hacia abajo, con el lado izquierdo hacia arriba) (Figura 2B1).
   2. Con unas pinzas finas, baje un alfiler de 0,035 mm perpendicular a la larva y a la cámara. Inserte el pasador de la cabeza entre el ojo y la vesícula ótica y hacia abajo en el encapsulante (Figuras 1B1 y 1B2). Use un segundo juego de fórceps para estabilizar la larva a lo largo de su lado dorsal o ventral mientras la sujeta. Asegúrese de que la parte horizontal del pasador entre en contacto con la larva y no presione completamente el encapsulante. Incline el alfiler ventralmente (Figura 1B1) o apuntando ligeramente hacia la parte anterior del pez para evitar interferir con la inyección cardíaca posterior y las imágenes de células ciliadas.
      1. Con las pinzas, inserte un pasador de cola de 0,025 mm en la notocorda lo más cerca posible del final de la cola (Figura 1B1).
         NOTA: Tenga cuidado de evitar estirar la larva. Fija la larva plana. Los ojos deben estar superpuestos (Figura 2B1). Esto es muy importante para facilitar la inyección en el corazón (Figura 1B2-B2', paso 3), facilitar un plano de imagen deseable (Figura 1B1-B2'', pasos 5) y cuantificar la intensidad del estímulo del chorro de líquido (Figura 3A3, paso 4).
2. Inyección de α-bungarotoxina en la cavidad cardíaca para paralizar la larva

NOTA: Use guantes cuando manipule α-bungarotoxina.

1. Centrifugar la alícuota de α-bungarotoxina brevemente antes de usarla para evitar la obstrucción de la aguja de inyección cardíaca.
   1. Rellene 3 μl de solución de α-bungarotoxina en una aguja de inyección cardíaca con una punta de pipeta de carga de gel. Cargue la solución uniformemente hasta la punta sin burbujas.
   2. Inserte la aguja de inyección cardíaca en un soporte de pipeta conectado a un micromanipulador manual. Bajo un microscopio estereoscópico, coloque la aguja de modo que esté alineada perpendicularmente al eje AP de las larvas clavadas y anestesiadas, apuntando hacia abajo en un ángulo de ~ 30 °.
   3. Conecte el soporte de la pipeta al inyector a presión. Aplique los siguientes ajustes sugeridos: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s y Pcompensation = 5 hPa. Inyecte un bolo en la solución para probar si la punta de la aguja es permeable.
   4. Busque una pequeña bocanada de la solución roja (de rojo fenol) para salir de la punta de la aguja. Si no se ve ningún color rojo, raspe muy suavemente la punta de la aguja contra el borde de un alfiler y vuelva a intentarlo hasta que la aguja esté patente. Alternativamente, tire de una aguja con una abertura de punta más grande.
2. Avance la aguja hacia el corazón hasta que toque la piel fuera del corazón (Figura 1B2). Presione la aguja en la larva y busque una hendidura de la célula pigmentaria en la piel frente al corazón para asegurarse de que la aguja esté colocada en el plano correcto en relación con la larva (Figura 1B2 ').
   1. Avanza la aguja más hasta que perfore la piel y entre en la cavidad cardíaca. Tire de la aguja ligeramente hacia atrás. Inyecte un bolo de α-bungarotoxina en la cavidad cardíaca. Busque inflación de la cavidad cardíaca o tinte rojo que ingrese a la cavidad.
3. Enjuague suavemente la larva 3 veces con 1 ml de tampón neuronal (NB) para eliminar el MS-222 residual. Nunca elimine todo el líquido. Mantenga la larva en aproximadamente 1 ml de NB en la cámara de perfusión.
   NOTA: Asegúrese de que los latidos cardíacos y el flujo sanguíneo de las larvas permanezcan robustos después de la fijación y la inyección en el corazón y durante todo el experimento de imágenes.
4. Preparación del microscopio y la configuración de chorro de fluido
   1. Ensamble un microscopio confocal vertical utilizando los componentes descritos en la tabla de materiales: un microscopio confocal con un láser de 488 nm y filtros apropiados, software de microscopio para controlar y coordinar imágenes y estimulación, objetivo de aire 10x, objetivo de agua 60x, escáner de objetivo piezo-Z (para pilas z), cámara de alta velocidad, cámara circular adaptador, platina motorizada y adaptador de inserto de platina.
   2. Ensamble el chorro de fluido compuesto por 3 componentes principales: una bomba de vacío y presión, una abrazadera de presión de alta velocidad y una etapa de cabeza (también descrita en la Tabla de materiales). Utilice la pinza de presión de alta velocidad para controlar el tiempo y la duración de la descarga de presión o vacío fuera de la etapa de cabezales y dentro de la pipeta de chorro de fluido.
      1. Conecte la salida de la platina principal al soporte de la pipeta de chorro de fluido a través de un tubo de silicona de paredes gruesas.
5. Alineación de larvas y chorro de fluido

NOTA: Hay 3 planos de interés dentro de cada neuromast: (1) las puntas de los mechones de cabello (Figura 3A3: los kinocilios, utilizados para medir la intensidad del estímulo); (2) el plano de mecanotransducción del haz de cabello (MET) (Figura 2B1-B1': la base de los haces de cabello apicales donde se detectan señales de calcio dependientes del canal MET); y (3) el plano sináptico (Figura 2B2-B2': donde se detectan señales de calcio presinápticas en la base de la célula ciliada). Estos planos se describen en la Figura 2A.

1. Rellene 10 μL de NB en una aguja de chorro de fluido correctamente rota utilizando una punta de carga de gel. Cargue la solución uniformemente hasta la punta sin burbujas. Inserte la aguja en el soporte de la pipeta conectado al micromanipulador motorizado.
2. Coloque la cámara de perfusión en un adaptador de cámara circular en la platina del microscopio. nota: Para mantener la consistencia, siempre coloque la larva en la misma orientación (p. ej., la cámara que contiene la larva con su parte posterior hacia el chorro de fluido y el lado ventral hacia el experimentador).
   1. Mueve la etapa motorizada para que la larva esté en el centro del campo de visión. Gire el adaptador de cámara circular para que el eje anteroposterior (AP) de la larva esté aproximadamente alineado con la trayectoria de la aguja de chorro de fluido.
   2. Usando luz transmitida y contraste de interferencia diferencial (DIC), enfoca la larva y céntrala debajo del objetivo 10x. Aumenta el objetivo 10x.
3. Usando el micromanipulador motorizado, baje la aguja de chorro de fluido hacia el centro del campo de visión para que sea iluminada por la luz transmitida y apenas toque la solución NB.
   1. Baja el objetivo 10x. Concéntrese en la larva para confirmar su ubicación. Concéntrese hacia arriba para encontrar la aguja de chorro de fluido. Mueva la aguja de chorro de fluido con el micromanipulador en los ejes x e y hasta que esté en una posición paralela al lado dorsal del pez.
   2. Concéntrese nuevamente en la larva. Baja la aguja en el eje z. Coloque la aguja a lo largo del lado dorsal del pez y a ~ 1 mm del cuerpo (Figura 3A1).
   3. Mueva con cuidado el adaptador de cámara circular (si es necesario) para asegurarse de que la aguja de chorro de fluido esté alineada a lo largo de la línea media A-P de la larva (Figura 3A1).
   4. Mueva la platina motorizada para colocar el neuromástil de interés en el centro del campo de visión. Mantenga la punta de la aguja de chorro de líquido a lo largo del lado dorsal del pez. No toque la punta de la aguja de chorro de fluido con la larva o la superficie de la cámara.
4. Cambia al objetivo de agua 60x. Asegúrese de que el objetivo esté inmerso en la solución NB. Utilice el enfoque fino para localizar un neuromástil utilizando luz transmitida y óptica DIC.
   NOTA: Esta configuración está diseñada para estimular los neuromástiles a lo largo de la línea lateral posterior primaria. Las células ciliadas dentro de estos neuromastos responden al flujo de fluido dirigido anterior o posterior.
   1. Coloque la aguja de chorro de fluido con el micromanipulador de modo que esté a 100 μm del borde exterior del neuromástil (Figura 3A2).
      NOTA: Elija neuromástiles que ofrezcan vistas claras de arriba hacia abajo (Figuras 2B1'-B2' y Figura 3A3) en lugar de vistas en ángulo lateral (Figura 2C1-C2). Una vista clara de arriba hacia abajo permite obtener imágenes simultáneas de todos los haces de cabello apical en un solo plano óptico o imágenes de áreas sinápticas en menos planos ópticos (Figura 3A3).
   2. Enfoque hasta las puntas de los haces de pelo apicales (kinocilios) (Figura 1A, Figuras 3A2 y 3A3). La parte inferior de la aguja de chorro de fluido debe estar enfocada en este plano.
5. Configure la pinza de presión de alta velocidad del modo manual al externo para recibir información del software de imágenes.
   1. Ponga a cero la abrazadera de presión de alta velocidad presionando el botón "cero". Utilice la perilla de punto de ajuste para ajustar la presión de reposo ligeramente positiva (~2 mmHg). Confirme la salida de reposo de la pinza de presión de alta velocidad con un manómetro de libras por pulgada cuadrada (PSI) conectado a la salida de la platina de cabeza.
      NOTA: Establezca una presión ligeramente positiva en reposo para evitar la absorción gradual de fluido en la aguja de chorro de fluido con el tiempo. Si el fluido ingresa al tubo conectado al chorro de fluido y llega a la etapa de cabeza, puede dañar el equipo.
   2. Determina la presión necesaria para estimular los mechones de cabello. Utilice una entrada de 0,125 y 0,25 V (6,25 y 12,5 mmHg) durante 200-500 ms para aplicar un estímulo de prueba (Figura 3A3-A3'').
      NOTA: La pinza amperimétrica de alta velocidad convierte una entrada de voltaje (desde el software u otros dispositivos que se conectan al puerto Bayonet Neill-Concelman (BNC) en el puerto de comando de la pinza amperimétrica de alta velocidad) en presión que se descarga desde la platina principal, y, en última instancia, la aguja de chorro de fluido (1,0 V = 50 mmHg, mientras que -1,0 V = -50 mmHg). En esta configuración (ver paso 4.2) la presión positiva (empuje) desvía los mechones de cabello hacia la parte anterior, y la presión negativa (tracción) desvía los mechones de cabello hacia la parte posterior.
   3. Usando luz transmitida y óptica DIC junto con una barra de escala, mida la distancia de desviación por los estímulos de 6.25 y 12.5 mmHg de las puntas de los mechones de cabello, la kinocilia (Figura 2A y Figuras 3A3-3 ''). Elija una presión que mueva los haces (como 1 unidad cohesiva) a una distancia de aproximadamente 5 μm (Figura 3A3''). Asegúrese de que las puntas de la kinocilia permanezcan enfocadas todo el tiempo.
   4. Mueva el chorro de fluido ± 25 μm a lo largo del eje A-P de la larva para encontrar una distancia y presión que desvíe las puntas de la kinocilia 5 μm.
      NOTA: Usando GCaMP6 en larvas de 3 a 7 días después de la fertilización (dpf), una desviación de 5 μm debería lograr señales de calcio de GCaMP6 casi saturadas y no debería dañar las estructuras apicales del haz de pelos (Figura 3A3 ''). Se pueden usar distancias de desplazamiento más pequeñas para administrar estímulos no saturantes (Figura 3A3'). Las distancias de desplazamiento >10 μm son difíciles de estimar (Figura 3A3''') y pueden ser dañinas con el tiempo. La saturación de la señal depende de la edad del neuromástil (y de la altura del kinocilial), así como del indicador utilizado. Verifique la permeabilidad de la aguja de chorro de fluido en cada dirección (presión/empuje y vacío/tracción) periódicamente durante la obtención de imágenes. Las agujas de chorro de fluido se obstruyen fácilmente y pierden permeabilidad al vacío, pero mantienen la permeabilidad de la presión residual. Use óptica DIC y un estímulo de prueba corto en cada dirección para verificar la permeabilidad del chorro de fluido.
   5. Enfoque la muestra en el plano de interés (p. ej., la base de los haces pilosos apicales o la base de la célula ciliada en el plano sináptico; Figura 2B1-B2').
6. Procedimiento de adquisición de imágenes: adquisición de un solo plano

NOTA: Todas las imágenes descritas en este protocolo se realizan a temperatura ambiente (RT).

1. Configure el software de imágenes para adquirir una transmisión o una adquisición continua de 80 fotogramas con una captura cada 100 ms para lograr una velocidad de fotogramas de 10 Hz.
2. Configure la ganancia, la apertura y la potencia del láser para optimizar la detección de señales, pero evite la saturación, el fotoblanqueo y el ruido. Los ajustes de ejemplo para un Opterra/SFC son los siguientes: Potencia del láser de 488 nm: 50 (plano MET del haz de pelo), 75 (plano sináptico); hendidura de 35 μm; ganancia = 2,7; Ganancia EM = 3900.
   NOTA: Aplique 2 X binning si las señales son demasiado débiles o ruidosas o tienen un fotoblanqueo excesivo. 2 X binning mejorará la detección de señales a costa de la resolución espacial.
3. Seleccione un estímulo para administrar durante la adquisición de 80 cuadros (8 s) después del cuadro 30, a 3 s.
   NOTA: Algunos ejemplos de estímulos son los siguientes: 200 ms (+ o - 0,25 V) hasta 2 s (+ o - 0,25 V) paso en la dirección anterior o posterior para identificar la sensibilidad direccional de cada célula ciliada; 2 s, Onda cuadrada de 5 Hz (0,25 V durante 200 ms, -0,25 V durante 200 ms, repetida 5 veces) para estimular todas las células ciliadas simultáneamente. Una presión positiva (estímulo anterior) activará la mitad de las células ciliadas. Una presión negativa (estímulo posterior) activará la otra mitad de las células ciliadas. Asegúrese de que el software o dispositivo de estímulo devuelva la pinza de presión a 0 V después de que finalice el estímulo.
4. Medir las respuestas mecanosensibles al calcio. Concéntrese en la base de los haces de pelo apicales (Figuras 2A y 2B1-B1') e inicie la adquisición de imágenes.
   NOTA: Si el neuromast se ve claramente de arriba hacia abajo (Figura 2B1-B1'), se pueden obtener imágenes de todos los haces de pelo apicales simultáneamente en un solo plano.
5. Medir las respuestas presinápticas de calcio. Concéntrese en la base de las células ciliadas (Figuras 2A y 2B2-B2') e inicie la adquisición de imágenes.
   NOTA: Si el neuromast se ve claramente de arriba hacia abajo (Figura 2B2-B2'), los planos de imagen presinápticos de todas las células ciliadas se pueden adquirir en 2-3 planos separados por 2 μm. Los peces transgénicos Tg se pueden usar para identificar y localizar cintas presinápticas y sitios de entrada de calcio.

Resultados

Figura 1: Cámara de imágenes, montaje de pez cebra y procedimientos de inyección en el corazón, y agujas. (A) Se muestra una cámara de imágenes con una larva (delineada por un rectángulo discontinuo) fijada en el centro sobre el encapsulante ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	Para paralizar larvas antes de la imagen
Cámara de imágenes	Siskiyou	PC-R	Plataforma para montar larvas para imágenes
No. 1.5 Cubreobjetos cuadrados, 22*22 mm	VWR	48366-227	Para sellar la cámara de imagen
Grasa de silicona de alto vacío	Fischer Scientific	14-635-5D	Para la fijación del cubreobjetos a la cámara de imagen
Kit de encapsulante de silicona transparente de 0,5 g	Adhesivos Ellsworth Dow	Corning Sylgard, 184 KIT SIL ELAST 0,5KG	Para llenar la cámara de imagen y crear una superficie para clavar peces
Estereomicroscopio	Carl Zeiss Microscopía	Stemi 2000 con iluminación de luz transmitida	Para iluminar alambre, pinzas y tijeras para hacer alfileres Pinzas
finas	ciencia fina	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Artículo No. 11295-10	Para hacer alfileres
Tijeras finas	Cole-Palmer	5.5", EW-10818-00	Para cortar alambre de tunsgten para hacer alfileres
Alambre de tungsteno, 0.035 mm	Goodfellow	W005131	Para alfileres de cabeza para inmovilizar larvas
Alambre de tungsteno, 0.025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	Para pasadores de cola para inmovilizar larvas Capilares
de vidrio de borosilicato sin filamento	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Vidrio para ser arrastrado en agujas de chorro de fluido para estimular las células ciliadas
Pinzas finas	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Artículo No. 11295-10	Para fijar larvas
Gel Puntas de carga	Eppendorf	5242956003	Para rellenar agujas de inyección cardíaca
Microscopio estereoscópico	Carl Zeiss Microscopía	Stemi 2000 con iluminación de luz transmitida	Para iluminar larvas durante la fijación y la inyección cardíaca
Capilar/portaagujas de vidrio	WPI	MPH315	Para sujetar agujas de chorro de fluido
Micromanipulador manual	Narishige	M-152	Para sujetar y posicionar el portaagujas para inyectar α-bungarotoxina
Soporte magnético	Narishige	GJ-1	Para sujetar micromanipulador manual para inyección de α-bungarotoxina
Inyector de presión	Eppendorf	Femtojet 4x	Para administrar α-bungarotoxina
Microscopio confocal	Bruker	Microscopio confocal de campo barrido/Opterra	Microscopio fijo y vertical con óptica DIC y láser de 488 nm con filtros adecuados
Software de microscopio	Bruker	Prairieview 5.3	Para coordinar y controlar el microscopio, los láseres, la platina, el piezo-z, las cámaras y el objetivo de aire de chorro de fluido
10x	Nikon	MRH00101	Aumento bajo para el posicionamiento de larvas y el objetivo de agua de chorro de fluido
de 60x	Nikon	MRF07620	Objetivo de inmersión en agua con alta NA (1,0) y distancia de trabajo adecuada (2,0 mm)
Escáner de objetivo piezo-Z con controlador/controlador	Instrumentos Physik Intruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	Adquisición de pila Z de alta velocidad con precisión de 0,025um
Cámara EMCCD	QImaging	Rolera EM-C2 Cámara EMCCD	Cámara con tamaño de píxel pequeño que puede adquirir hasta 100 fotogramas por s
Adaptador	de cámara circularSiskiyou	PC-A	Para sujetar y rotar la cámara de imágenes en la platina
del microscopio Platina motorizada de la cubierta en Z	Prior Scientific	ZDN12MP	Platina de microscopio que puede sostener y mover la muestra y el micromanipulador con aguja de chorro de fluido juntos
Adaptador de inserto de platina de la plataforma en Z NIH	Taller de máquinas	personalizado	Para colocar el adaptador de cámara circular en la platina de la plataforma z
Aparato	de chorro de fluidoInstrumentos científicos ALA	HSPC-1 Abrazadera de presión de alta velocidad con PV-PUMP	Para controlar y administrar el estímulo de chorro de fluido
Tubo de silicona curado con peróxido Masterflex (1 pie)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	Para conectar el portaagujas de chorro de fluido a la bomba de presión
Micromanipulador motorizado	Sutter Instrument Company	MP-225	Para sujetar y posicionar el portaagujas para fluido controlador de micromanipulador de chorro
	Sutter Instrument Company	MPC-200	Para controlar el manipulador de agujas de chorro de fluido
Puntas de carga de gel	Eppendorf	5242956003	Para rellenar agujas de chorro de fluido
Capilar de vidrio/portaagujas	WPI	MPH315	Para sujetar agujas de chorro de fluido
Manómetro PSI	Sper Scientific		840081 Para medir salida de pinza de presión
Prism7	Graphpad	Prism7	Software para trazar cambios
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/	Software para procesar imágenes y crear mapas de señales espacio-temporales
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Plugin para registrar secuencias de imágenes GCaMP6 en FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Plugin para registrar secuencias de imágenes GCaMP6 en FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Departamento de Neurobiología, UCLA	a href='https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html'>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Plugin para crear múltiples ROI para medir los cambios de intensidad de GCaMP6

Herramientas de de intensidad GCaMP6<