Imágenes de la dinámica del calcio en las células ciliadas de la línea lateral de las larvas de pez cebra

Resumen

Fuente: Lukasz, D., et al. Imágenes de calcio in vivo de células ciliadas de la línea lateral en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra imágenes en vivo de la afluencia de calcio en las células ciliadas de la línea lateral de una larva de pez cebra transgénica paralizada utilizando un microscopio confocal. La estimulación mecánica de los mechones de cabello a través de pulsos de fluido induce la entrada de calcio a través de canales de mecanotransducción y canales dependientes de voltaje, que se visualiza en tiempo real mediante indicadores de fluorescencia. El método destaca la dinámica del calcio apical y basal en las células ciliadas del neuromastilo, dilucidando su papel en la detección del movimiento del agua.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Fijación e inmovilización de larvas en la cámara de imágenes
   1. Bañe una larva Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) en aproximadamente 1 ml de tampón de tampón embrionario (E3) que contenga 0,04% de MS-222 durante 1–2 min en la superficie encapsulante de silicona de la cámara de imágenes hasta que la larva se vuelva inmóvil o no responda al tacto.
      1. Bajo un microscopio estereoscópico, coloque la larva en el centro de la cámara de perfu....

Resultados

Figura 1: Cámara de imágenes, montaje de pez cebra y procedimientos de inyección en el corazón, y agujas. (A) Se muestra una cámara de imágenes con una larva (delineada por un rectángulo discontinuo) fijada en el centro sobre el encapsulante .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	Para paralizar larvas antes de la imagen
Cámara de imágenes	Siskiyou	PC-R	Plataforma para montar larvas para imágenes
No. 1.5 Cubreobjetos cuadrados, 22*22 mm	VWR	48366-227	Para sellar la cámara de imagen
Grasa de silicona de alto vacío	Fischer Scientific	14-635-5D	Para la fijación del cubreobjetos a la cámara de imagen
Kit de encapsulante de silicona transparente de 0,5 g	Adhesivos Ellsworth Dow	Corning Sylgard, 184 KIT SIL ELAST 0,5KG	Para llenar la cámara de imagen y crear una superficie para clavar peces
Estereomicroscopio	Carl Zeiss Microscopía	Stemi 2000 con iluminación de luz transmitida	Para iluminar alambre, pinzas y tijeras para hacer alfileres Pinzas
finas	ciencia fina	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Artículo No. 11295-10	Para hacer alfileres
Tijeras finas	Cole-Palmer	5.5", EW-10818-00	Para cortar alambre de tunsgten para hacer alfileres
Alambre de tungsteno, 0.035 mm	Goodfellow	W005131	Para alfileres de cabeza para inmovilizar larvas
Alambre de tungsteno, 0.025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	Para pasadores de cola para inmovilizar larvas Capilares
de vidrio de borosilicato sin filamento	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Vidrio para ser arrastrado en agujas de chorro de fluido para estimular las células ciliadas
Pinzas finas	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Artículo No. 11295-10	Para fijar larvas
Gel Puntas de carga	Eppendorf	5242956003	Para rellenar agujas de inyección cardíaca
Microscopio estereoscópico	Carl Zeiss Microscopía	Stemi 2000 con iluminación de luz transmitida	Para iluminar larvas durante la fijación y la inyección cardíaca
Capilar/portaagujas de vidrio	WPI	MPH315	Para sujetar agujas de chorro de fluido
Micromanipulador manual	Narishige	M-152	Para sujetar y posicionar el portaagujas para inyectar α-bungarotoxina
Soporte magnético	Narishige	GJ-1	Para sujetar micromanipulador manual para inyección de α-bungarotoxina
Inyector de presión	Eppendorf	Femtojet 4x	Para administrar α-bungarotoxina
Microscopio confocal	Bruker	Microscopio confocal de campo barrido/Opterra	Microscopio fijo y vertical con óptica DIC y láser de 488 nm con filtros adecuados
Software de microscopio	Bruker	Prairieview 5.3	Para coordinar y controlar el microscopio, los láseres, la platina, el piezo-z, las cámaras y el objetivo de aire de chorro de fluido
10x	Nikon	MRH00101	Aumento bajo para el posicionamiento de larvas y el objetivo de agua de chorro de fluido
de 60x	Nikon	MRF07620	Objetivo de inmersión en agua con alta NA (1,0) y distancia de trabajo adecuada (2,0 mm)
Escáner de objetivo piezo-Z con controlador/controlador	Instrumentos Physik Intruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	Adquisición de pila Z de alta velocidad con precisión de 0,025um
Cámara EMCCD	QImaging	Rolera EM-C2 Cámara EMCCD	Cámara con tamaño de píxel pequeño que puede adquirir hasta 100 fotogramas por s
Adaptador	de cámara circularSiskiyou	PC-A	Para sujetar y rotar la cámara de imágenes en la platina
del microscopio Platina motorizada de la cubierta en Z	Prior Scientific	ZDN12MP	Platina de microscopio que puede sostener y mover la muestra y el micromanipulador con aguja de chorro de fluido juntos
Adaptador de inserto de platina de la plataforma en Z NIH	Taller de máquinas	personalizado	Para colocar el adaptador de cámara circular en la platina de la plataforma z
Aparato	de chorro de fluidoInstrumentos científicos ALA	HSPC-1 Abrazadera de presión de alta velocidad con PV-PUMP	Para controlar y administrar el estímulo de chorro de fluido
Tubo de silicona curado con peróxido Masterflex (1 pie)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	Para conectar el portaagujas de chorro de fluido a la bomba de presión
Micromanipulador motorizado	Sutter Instrument Company	MP-225	Para sujetar y posicionar el portaagujas para fluido controlador de micromanipulador de chorro
	Sutter Instrument Company	MPC-200	Para controlar el manipulador de agujas de chorro de fluido
Puntas de carga de gel	Eppendorf	5242956003	Para rellenar agujas de chorro de fluido
Capilar de vidrio/portaagujas	WPI	MPH315	Para sujetar agujas de chorro de fluido
Manómetro PSI	Sper Scientific		840081 Para medir salida de pinza de presión
Prism7	Graphpad	Prism7	Software para trazar cambios
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/	Software para procesar imágenes y crear mapas de señales espacio-temporales
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Plugin para registrar secuencias de imágenes GCaMP6 en FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Plugin para registrar secuencias de imágenes GCaMP6 en FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Departamento de Neurobiología, UCLA	a href='https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html'>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Plugin para crear múltiples ROI para medir los cambios de intensidad de GCaMP6

Herramientas de de intensidad GCaMP6<