$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal correspondiente.
1. Preparación
1. Peina cada músculo en pequeños haces de fibras de aproximadamente 1 mm de ancho con dos pinzas dentadas finas.
NOTA: Es crucial manipular los músculos muy suavemente con las pinzas, sin fuerza excesiva, para evitar daños en los tejidos durante las burlas.
1. Disociar el músculo tibial anterior (TA) en 3 o 4 haces dependiendo de su tamaño.
2. Para el gastrocnemio (GA), separe las partes medial y lateral del músculo y luego disocie cada parte en 4-5 haces dependiendo de su tamaño.
2. Inmunotinción
1. Proceda con la permeabilización de las fibras musculares: Transfiera los haces musculares a placas de 24 pocillos que contengan 1% (v/v) de Triton X-100 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y manténgalos bajo agitación suave (50 rpm) durante 1 h a temperatura media o 5 horas a 4 °C.
NOTA: Divida los haces musculares entre dos placas para proceder con inmunotinciones separadas y minimizar el riesgo de confusión de anticuerpos. No los divida en más de dos pocillos (1 pozo / placa); de lo contrario, el número (N) de uniones neuromusculares (NMJ) que son representativas de su estado general en el músculo analizado puede ser insuficiente.
2. Lavar las muestras 3 veces durante 5 min con PBS a temperatura ambiente e incubarlas con una solución bloqueante compuesta por albúmina sérica bovina (BSA) al 4% en PBS/Triton X-100 al 1% durante 4 h a 4 °C, bajo agitación suave (50 rpm).
NOTA: No utilice una bomba de aspiración durante los pasos de lavado, sino que aspire la solución manualmente con una pipeta de 200 μL y puntas de tamaño pequeño (la referencia se indica en la Tabla de materiales).
3. Incubar las muestras durante la noche (O/N) a 4 °C bajo agitación suave (50 rpm) con la solución bloqueadora indicada en el paso 2.2 que contiene anticuerpos monoclonales primarios contra neurofilamentos M (NF-M, 2H3, dilución 1/200) o glicoproteína 2 de vesículas sinápticas (SV2, dilución 1/200) para marcar terminales axónicos presinápticos o zonas activas, respectivamente.
4. Al día siguiente, lave los haces musculares 3 veces durante 5 minutos en PBS bajo agitación (50 rpm).
1. Para imágenes confocales: Incube los haces musculares con anticuerpos secundarios anti-ratón conjugados con un fluoróforo emisor de rojo (F594) (dilución 1/500) y α-bungarotoxina conjugada con un fluoróforo emisor de verde (α-BTX-F488) (dilución 1/1000) en PBS durante 2 h a RT bajo agitación (50 rpm).
2. Para imágenes de agotamiento por emisión estimulada (STED): Incube los haces musculares con anticuerpos secundarios anti-ratón conjugados con un fluoróforo emisor de verde (F488) (dilución 1/500) y α-bungarotoxina conjugada con un fluoróforo emisor de rojo lejano caracterizado por una alta fotoestabilidad (α-BTX-F633) (dilución 1/1000) en PBS durante 2 h a RT bajo agitación (50 rpm).
NOTA: No exponga las muestras a la luz durante la incubación para evitar el fotoblanqueo.
5. Lave los haces musculares etiquetados 3 veces durante 5 minutos con PBS bajo agitación (50 rpm) y colóquelos en un portaobjetos con un medio de montaje.
NOTA: Coloque un máximo de 4 a 5 haces musculares por portaobjetos para permitir el sellado.
6. Añade un cubreobjetos de vidrio de grado #1,5 (o #1,5H) (0,17 mm de grosor) en la parte superior, y coloca imanes cilíndricos a ambos lados del portaobjetos para aplicar presión y aplanar los músculos.
7. Mantenga las diapositivas protegidas de la luz O/N a 4 °C. Selle las diapositivas permanentemente con esmalte de uñas.
3. Adquisición de imágenes
1. Adquisiciones mediante un microscopio confocal
NOTA: Las imágenes se recopilaron con un microscopio confocal de barrido láser invertido utilizando un objetivo de inmersión en aceite de magnitud 63x (HCX Plan Apo CS, apertura numérica (NA) de 1,4
).
1. Para un análisis ciego, deje que una persona que no esté involucrada en el análisis codifique cada diapositiva con un número dado. Permanezca cegado a los grupos experimentales hasta que se complete la cuantificación de los parámetros de NMJ para todas las muestras.
2. Inicie el software del microscopio en el modo de configuración > >machine.xlhw.
3. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y encuentre el plano de observación dentro de la muestra mirando bajo la iluminación de fluorescencia de campo amplio DAPI con el conjunto de filtros DAPI.
4.Haga clic en Abrir proyecto > nuevos proyectos> y cree una carpeta para almacenar las adquisiciones de imágenes.
NOTA: Cree un nuevo proyecto para cada NMJ para limitar el tamaño de la carpeta y evitar problemas de memoria del equipo.
5. Para administrar los parámetros de adquisición, haga clic en la ventana de la pestaña Adquisición y configure el estenopeico confocal en 1.0 unidad Airy y la potencia del láser para optimizar los niveles de ganancia y compensación para la fluorescencia verde / F488 (α-BTX) utilizando un láser de 488 nm en la placa final que debe ser fotografiada (modo en vivo activado).
6. A continuación, optimice la adquisición de fluorescencia roja/F594 (NF-M o SV2) utilizando un láser adaptado a la observación F594. En este estudio, se utilizó un láser de 552 nm (modo Live ON). Establezca el espectro de emisión de colorante con los siguientes rangos para cada láser: láser 405 (DAPI) de 414 a 483 nm, láser 488 (F488-α-BTX) de 506-531 nm y láser 552 (NFM/ SV2) de 622-650 nm.
7. Recopile pilas de imágenes de uniones neuromusculares en cada grupo experimental con la misma configuración: tamaño de imagen 1024 x 1024 píxeles (73,7 x 73,7 μm) a una frecuencia de muestreo de 400 Hz, bidireccional X ON, factor de zoom 2,5, tamaño de paso Z 0,5 μm en modo Z-Wide.
NOTA: Para cada NMJ, el número de cortes se establece para adquirir toda la unión. Los ajustes de adquisición descritos anteriormente cumplen con el teorema de muestreo de Nyquist-Shanon. Sin embargo, el usuario puede hacer clic en el botón Optimizar formato, presente en todos los programas operativos confocales recientes, para asegurarse de que el tamaño de píxel y el paso Z cumplan con la frecuencia de muestreo ideal de Nyquist. Esta acción evitará imágenes sobremuestreadas o submuestreadas, lo que provocará una pérdida de precisión en las mediciones de volumen.
8. Guarde el archivo original (.lif) o las imágenes de la pila Z (.tif) en una carpeta con un nombre que incluya el nombre en clave de la diapositiva, el tipo de tinción y el número de la placa terminal.
NOTA: Recopile secuencialmente (no simultáneamente) los escaneos utilizando los láseres de 488 nm y 552 nm (F488 y F594) para evitar la diafonía de la fluorescencia F488 en el canal F594 y viceversa (sangrado). La trayectoria del haz se puede configurar con el Dye Assistant en el software del microscopio.
9. Cambie a la siguiente diapositiva codificada y repita los pasos 3.1.3-3.1.8 para cada NMJ.
10. Al final de la sesión, haga clic en Abrir en el visor 3D y elija un representante de NMJ de un grupo experimental para visualizar el etiquetado 3D.
NOTA: Este modo de vista ayudará a verificar que los parámetros de adquisición sean correctos.
11. Cierre el software del microscopio, limpie los objetivos con pañuelos de lente y luego apague el sistema.
2. Adquisiciones por microscopía STED
NOTA: Las imágenes se recopilaron con un microscopio confocal de barrido láser invertido equipado con Gated STED a 775 nm utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100x (HC PL APO CS2 1.4 NA).
1. Para un análisis ciego, deje que una persona que no esté involucrada en el análisis codifique cada diapositiva con un número dado. Permanezca cegado a los grupos experimentales hasta que se complete la cuantificación de los parámetros de NMJ para todas las muestras.
2. Inicie el software del microscopio en el modo de configuración > machine.xlhw y STED ON.
3. Haga clic en Abrir proyecto > Nuevos proyectos para crear una carpeta para almacenar las adquisiciones de imágenes.
>NOTA: Genere una nueva carpeta para cada diapositiva para limitar el tamaño de la carpeta y evitar problemas de memoria de la computadora.
4. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y visualícelo bajo iluminación de fluorescencia de campo amplio utilizando el láser de 488 nm para encontrar el plano de observación dentro de la muestra.
5. Busque un NMJ marcado con tinción de neurofilamento M (NFM) o SV2 utilizando el láser de 488 nm con una detección espectral de 506-531 nm.
6. Cuando se haya identificado un NMJ, haga clic en Activar STED y comience a adquirir imágenes en una región que contenga varios pliegues de unión utilizando el láser de 635 nm con una detección espectral de 640-750 nm.
>NOTA: Tenga cuidado con la tabla de búsqueda de saturación durante la adquisición de imágenes y haga clic en el botón Quick LUT para evitar la sobreexposición (valores de gris >255; para 8 bits).
7. Recopile las imágenes de cada grupo experimental con la misma configuración: tamaño de imagen 2048 x 2048 píxeles (38,75 x 38,75 μm) a una frecuencia de muestreo de 400 Hz.
NOTA: La potencia del láser de agotamiento (STED) se establece en 65%.
8. Guarde las imágenes con un nombre de archivo que incluya el código de la diapositiva.
NOTA: Es posible hacer clic en Formato XY optimizado: Establecer formato para obtener la mejor configuración de adquisición con imágenes STED.
9. Cambie a la siguiente diapositiva codificada y repita los pasos 3.2.3-3.2.8. Repita este procedimiento para todas las diapositivas.
10. Al final de la sesión de microscopía STED, transfiera los archivos de imagen a otro ordenador y guarde los archivos originales (.lif) en una unidad o servidor externo.
11. Apague el software del microscopio, limpie los objetivos con pañuelos de lente y luego apague el sistema.