Imágenes in vivo del transporte de líquido cefalorraquídeo en un cerebro de ratón mediante macroscopía de fluorescencia

Resumen

Fuente: Sweeney, A. M., et al. Imágenes in vivo del transporte de líquido cefalorraquídeo a través del cráneo de ratón intacto mediante macroscopía de fluorescencia. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra el proceso de visualización del flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en un cerebro de ratón mediante imágenes de fluorescencia. Se inyecta un marcador fluorescente en la cisterna magna (CM), lo que permite rastrear su movimiento con LCR a través de los espacios subaracnoideos y perivasculares. Las imágenes de lapso de tiempo capturan el viaje del marcador, destacando su distribución en el tejido cerebral a través de las arteriolas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Preparación de la cánula de la cisterna magna, la placa de la cabeza y el soporte de la cabeza

1. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y las placas de la cabeza antes de la cirugía.
   NOTA: Los trazadores fluorescentes se administran directamente en el LCR a través de una canulación de la cisterna magna.
2. Brevemente, con un destornillador de aguja, rompa la punta de una aguja de 30G x 12,7 mm (1/2 pulgada), 3/4 del camino hacia abajo, y coloque el extremo romo de la aguja en un extremo del tubo de polietileno 10 (PE10) (aproximadamente 45 cm de largo). Asegúrese de que solo el bisel sobresalga del borde del tubo PE10.
3. Rompa 1/4 del extremo biselado de otra aguja de 30G y coloque el extremo romo de la aguja restante en el otro extremo del tubo PE10, con el Luer-lock de plástico aún conectado.
4. Llene una jeringa de vidrio de 100 μL con LCR artificial estéril (aCSF: 126 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH₂PO₄, 2 mM de MgSO₄, 2 mM de CaCl₂, 10 mM de glucosa y 26 mM de NaHCO₃).
5. Coloque la jeringa al final de la línea y llénela con aCSF hasta que llegue a la punta de la aguja biselada. Es importante que la jeringa se rellene con aCSF y no con aire, ya que una columna de aire es más propensa a volúmenes de infusión variables.
6. Para experimentos crónicos, deje la línea llena de líquido cefalorraquídeo y omita el paso 1.7.
7. Para experimentos agudos, coloque la jeringa en una bomba de infusión y extraiga aproximadamente 5 mm de aire, lo que evitará la mezcla. A continuación, retire el volumen total de los trazadores que se deseen para el experimento (se recomienda un 20% adicional debido a las pérdidas de espacio muerto).
   NOTA: El tubo PE10 debe ser lo suficientemente largo para que la burbuja de aire no entre en el manguito de plástico de la jeringa de vidrio al cargar el marcador. Para un experimento típico, el protocolo utiliza 10 μL de albúmina sérica bovina conjugada con Alexa Fluor 647 (BSA-647) diluida en aCSF al 0,5%.
8. Confirme que la placa del cabezal encaja en el soporte del cabezal y que es del tamaño adecuado para el mouse que se está utilizando. Los marcadores anatómicos para garantizar esto son: el borde superior de la ventana se alinea con la línea interocular y el borde posterior cae rostral a la cresta occipital.
   NOTA: Las placas de cabeza de acero inoxidable se pueden esterilizar y reutilizar. La mayoría de las mezclas de cianoacrilato se pueden eliminar con una solución de acetona.

2. Procedimiento quirúrgico

1. Pesar y anestesiar al ratón (por ejemplo, ketamina/xilacina; 100 mg/kg de ketamina, 10 mg/kg de xilacina; i.p.).
2. Una vez que el ratón ya no responda a un pellizco en el dedo del pie, humedezca el cuello y la cabeza con agua estéril y afeite con una maquinilla. Una vez que el área esté afeitada, limpie el área con un hisopo con alcohol nuevamente para eliminar cualquier vello residual.
   NOTA: Humedecer el pelaje antes de recortar reduce drásticamente la cantidad de cabello en la ventana de imágenes después de la incisión.
3. Coloque el mouse en un marco estereotáctico encima de una almohadilla con temperatura controlada y aplique ungüento oftálmico de petróleo en los ojos del mouse para asegurarse de que no se sequen.
4. Limpie la piel expuesta con un hisopo de clorhexidina. Después de 2 min, retire la clorhexidina con una toallita con alcohol. Finalmente, aplique una solución de yodo que se puede dejar secar.
5. Inyecte analgesia subcutánea (Bupivacaína HCl al 0,25%) en la parte superior del cráneo y el cuello.
6. Comenzando en la parte del cuello que cubre la cresta occipital, haga un corte en la línea media en la piel suprayacente y continúe rostralmente hacia la línea interorbital. Incide lateralmente hasta el borde donde el músculo temporal se inserta en el cráneo. Retire toda la piel de la incisión fusiforme para exponer los huesos frontal y parietal.
   PRECAUCIÓN: El seno retroorbitario se encuentra caudal a los ojos y grandes ramas de la vena facial posterior se encuentran rostral al pabellón auricular. Tenga cuidado al hacer la incisión para evitar estas estructuras. Si esto ocurre, detenga el sangrado manteniendo la hemostasia con un hisopo de algodón estéril durante varios minutos y continúe.
7. Irriga el cráneo con solución salina estéril y limpia la superficie con bastoncillos de algodón para que esté libre de residuos y pelo, ya que estos interferirán con la calidad de la imagen. La mejor manera de preservar la transparencia del cráneo es dejando intactos el periostio y la fascia suprayacente.
   NOTA: Si estas estructuras se eliminan accidentalmente, el cráneo puede volverse seco y opaco con el tiempo. Vuelva a humedecer con aCSF o use una mezcla de aceite de parafina y glicerol para reducir la reflectancia del cráneo en experimentos agudos.
8. Proceder a insertar la cánula de la cisterna magna.
9. Después de insertar la cánula CM, aplique una mezcla de cemento dental con pegamento de cianoacrilato en el lado ventral de la placa de la cabeza alrededor del borde y colóquelo en el cráneo de modo que el borde anterior de la placa de la cabeza se alinee con la punta posterior del hueso nasal y el borde posterior se alinee con la cara anterior del hueso interparietal, asegurándose de que la sutura sagital (línea media) esté centrada y recta en relación con la ventana (Figura 1B).
10. Fije la posición de la placa de la cabeza con un par de gotas de acelerador de pegamento. Rellene los huecos restantes con la mezcla de cemento y cúrelo con acelerador.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el cianoacrilato no entre en contacto con los ojos del ratón ni bloquee la ventana de imágenes.
11. Pegue la cánula CM a la placa de la cabeza para asegurarse de que no se desprendan durante el transporte o cuando el ratón se despierte.
12. Para experimentos agudos, vaya al paso 2.16.
13. Para experimentos crónicos, aplique una capa delgada de pegamento de cianoacrilato de secado transparente en el cráneo expuesto, teniendo cuidado de no crear burbujas, ya que interferirán con las imágenes. El pegamento proporciona protección para el cráneo y no interferirá con las imágenes. Asegúrese de que el pegamento cubra el cráneo expuesto hasta la piel en el borde de la incisión.
14. Use una pinza hemostática para sujetar el tubo de PE10 lleno de aCSF a 2-3 cm del CM y corte la línea con una punta de cauterización de alta temperatura. Una vez separado, aplana el tubo de PE10 derretido para sellar la cánula.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de no soltar la abrazadera hasta que se haya sellado la cánula y confirme que no haya fugas en el tubo para evitar una fístula de LCR.
15. Administre carprofeno (5 mg / kg cada 24 h durante 3 días; intraperitoneal [i.p.] o subcutáneo [s.c.]) y devuelva al ratón a una jaula de una sola vivienda con temperatura controlada y deje que se recupere durante al menos 24 h antes de la imagen. No deje al ratón desatendido hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Las ventanas craneales intactas permanecen estables durante varias semanas. NOTA: El experimento crónico se puede pausar aquí.
    PRECAUCIÓN: Algunas complicaciones postoperatorias son: cefalohematoma/hematomas subgaleales, fístula de LCR e infección.
16. Para experimentos agudos, coloque el ratón en el soporte de la cabeza usando la placa de la cabeza para que el cráneo esté en una posición fija. Asegúrese de verificar el nivel de anestesia y coloque una almohadilla térmica debajo del mouse. El ratón ya está listo para ser llevado al macroscopio.
    PRECAUCIÓN: Transporte con cuidado el ratón junto con la bomba de infusión en un carro. Si la canulación de CM se desprende, provocará una caída de la presión intracraneal y cualquier fuga de LCR alterará los resultados experimentales.

3. Preparación del ratón para la obtención de imágenes

NOTA: El protocolo varía en función de si el experimento de obtención de imágenes se realizará en un ratón anestesiado (inicio en el paso 3.1) o despierto (inicio en el paso 3.2).

1. Ratones anestesiados
   1. Coloque el soporte de la cabeza en la platina del macroscopio, asegurándose de que no haya torceduras en la línea desde la bomba de jeringa hasta la cánula CM y que no esté tensa, ya que esto podría afectar la infusión del marcador.
   2. Observe la frecuencia respiratoria y la coloración rosada de las membranas mucosas, lo que indica una buena oxigenación. Inyecte solución salina por vía subcutánea para asegurar el nivel de hidratación si es necesario. Verifique que el animal esté lo suficientemente anestesiado y vuelva a dosificarlo si es necesario.
   3. Encienda la cámara del macroscopio y el diodo emisor de luz (LED) e inicie el modo LIVE.
   4. Confirme el aumento del campo de imágenes para que la sutura nasofrontal en la parte superior del campo y la sutura lambdoidea en la parte inferior se puedan visualizar claramente, con la sutura sagital paralela y centrada en el centro de la imagen (Figura 1C). Una vez en su lugar, asegure el soporte del cabezal a la etapa del macroscopio con cinta adhesiva.
   5. Enfoca el macroscopio en el cráneo expuesto. A pesar de que los macroscopios tienen una profundidad de campo relativamente grande, la curvatura del cráneo del ratón solo permite enfocar un área específica. Los mejores resultados se obtienen cuando el plano focal se encuentra en los lados laterales de los huesos parietales posteriores a las suturas coronales.
      NOTA: Esta es la ubicación de las arterias cerebrales medias (MCA), donde ocurre la mayor parte del flujo de LCR (Figura 1D, E).
2. Ratones despiertos
   1. Antes de la sesión de imágenes, deje que los animales se recuperen durante al menos 24 h de la cirugía de la placa de la cabeza. También se recomiendan períodos de recuperación más largos (5-7 días). Durante este tiempo, entrene al ratón para que se fije la cabeza en la platina del tubo de sujeción durante 0,5-1 h al día durante el período de recuperación.
      NOTA: La habituación permite que el ratón se fije al soporte de la cabeza sin anestesia y reduce el estrés y la ansiedad durante el experimento real. Si esto no es factible y la anestesia no interfiere con el experimento, se puede usar una dosis de inducción de un anestésico inhalado (por ejemplo, isoflurano al 2% a una tasa de flujo de O2 de 1-2 L / min) para unir rápidamente el ratón a la etapa de la cabeza.
   2. Una vez que el ratón esté fijado al soporte de la cabeza y en el tubo de sujeción, siga los pasos 3.1.1-3.1.5.

4. Infusión de trazadores fluorescentes de LCR

1. Cannulación aguda de CM
   1. Dado que el marcador ya estaba cargado en la cánula antes de colocarlo en la cisterna magna en el paso 1.6, ajuste la bomba de infusión a la velocidad y el volumen deseados. Los paradigmas de infusión utilizados habitualmente son de 5-10 μL a 1-2 μL/min, pero estos parámetros pueden ajustarse en función del experimento concreto, o del tamaño y la edad del animal.
2. Canulación crónica de CM
   1. Antes de comenzar la sesión de imágenes, siga los pasos 1.2-1.7 para experimentos agudos para preparar la línea de infusión para administrar los marcadores.
   2. Una vez preparada la vía, con una pinza hemostática se corta el extremo sellado de la cánula CM crónica. Tome la aguja de la línea preparada en el paso 4.2.1 e insértela suavemente en la cánula. Suelte la pinza y, con la bomba de jeringa, avance el marcador de LCR a la velocidad de infusión deseada (por ejemplo, 2 μL/min) para el experimento hasta que el marcador llegue a la aguja implantada en el CM.
      PRECAUCIÓN: Si la aguja atraviesa el tubo al conectar la línea, retire la aguja, corte el segmento perforado y repita este paso. Cualquier desgarro en el tubo PE10 causará una fuga y afectará los resultados del experimento.

5. Configuración de la sesión de imágenes

1. En función del trazador fluorescente que se infunde, determine la longitud de onda de excitación y el tiempo de exposición para cada canal. Elija el tiempo de exposición más corto necesario para visualizar el trazador con el fin de maximizar la resolución temporal de las imágenes de lapso de tiempo. Este tiempo de exposición se utilizará para todos los experimentos posteriores con el objetivo de comparar el transporte de LCR entre diferentes animales.
   NOTA: Un consejo es usar el marcador en la línea CM para ajustar el tiempo de exposición. Aunque este es un primer enfoque útil, debe optimizarse con el tiempo.
2. Elija la duración del experimento y los intervalos en los que se adquirirán las imágenes. Los experimentos normalmente duran entre 30 y 60 minutos, dependiendo de la fase del transporte linfático que sea de interés. Las velocidades de fotogramas de 1 fotograma/min y más rápidas son suficientes para la mayoría de los experimentos.
3. Establezca el nombre del archivo y el directorio de guardado.
4. Si las imágenes se recopilarán además de la adquisición simultánea de otras variables (por ejemplo, electrocardiograma, presión arterial arterial, electrofisiología), el macroscopio y la bomba se pueden programar para que se activen con un software de adquisición de datos. Compruebe que la función de activación en el macroscopio es correcta antes de pasar al siguiente paso.

6. Experimento de imágenes ópticas transcraneales

1. Inicie la infusión del marcador y la obtención de imágenes al mismo tiempo.
2. Revise rutinariamente la cánula CM y el tubo PE10 en busca de signos de fuga. Si hay alguna fuga de marcador en el MC, se deben excluir los resultados de este experimento.
   NOTA: Si el marcador comienza a acumularse en el cerebelo y no viaja por la vía glinfática de las arterias cerebrales medias (MCA), es probable que la cánula CM se haya inyectado en el cerebelo. Estos datos no deben incluirse.
3. Para experimentos agudos, después de completar el experimento, retire el ratón del microscopio y verifique que todavía esté adecuadamente anestesiado. Decapitar rápidamente al ratón y recolectar el tejido cerebral. Fije el cerebro por inmersión en paraformaldehído (PFA) al 4% durante la noche a 4 °C.
   1. Para experimentos crónicos, una vez que se completan las imágenes, retire la línea CM de la cánula, enjuague con aCSF estéril y vuelva a sellar la cánula CM con una punta de cauterización de alta temperatura. Retire el ratón del soporte para la cabeza y devuélvalo a su jaula. Repita este proceso hasta que no se requieran más imágenes y luego siga el paso 6.3.

Resultados

Figura 1. Imágenes macroscópicas transcraneales. (A) Esquema de la configuración de imágenes macroscópicas. (B) Vista dorsal de la posición de la placa de la cabeza en el cráneo. El hueso interparietal y los...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.25% Bupivacaína HCl			Jeringa
hermética de 100 μL Vivarium de la Universidad de Rochester Modelo 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Polvo
	Fisher Scientific	NC9991371
Carprofeno			Universidad de Rochester Vivarium
Clorhexidina	Prevantics	B10800
CMOS Cámara	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Placa de cabeza	Universidad de Rochester	Sin catálogo #	Hecho a medida en el taller de máquinas de la Universidad de Rochester
Cauterización de alta temperatura	Bovie Medical Corporation	AA01
Acelerador instantáneo Bob	Smith Industries	BSI-151
Isoflurano - Fluriso	Vet One	502017	Universidad de Rochester Vivarium
Ketamina			Strong Memorial Hospital
Pharmacy Krazy Glue	Elmer's Products, Inc	No hay catálogo #, ver enlace en comentarios	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Cinta quirúrgica Micropore	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldehído	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polietileno .011" x .024" por pie, 100 pies continuos	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Bomba 11 Elite Solo Infusión Jeringa Doble	Harvard Apparatus	70-4501
PURALUBE VET POMADA	Dechra
Puritan PurSwab Bastoncillos de limpieza con punta de algodón	Fisher Scientific	22-029-553
Microscopio de zoom macro	Olympus	MVX10
Placa de soporte de cabeza simple (para ratones)	Narishige International USA Inc	MAG-1
Agujas de un solo uso, BD Medical	VWR	BD305106
Almohadillas de preparación de alcohol estéril	Fisher Scientific	22-363-750
LED sintonizable	PRIOR Lumen 1600-LED
Xilacina			Universidad de Rochester Vivarium

de cemento dental de A-M Systems 81020 de Hamilton Company