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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.
1. Cateterismo intravenoso de roedores, administración de virus e implantación de fibra óptica
- Prepare a los animales para la cirugía.
- Anestesiar completamente a las ratas con el anestésico de su elección según las pautas institucionales. Una opción es el clorhidrato de ketamina (87,5-100 mg/kg, intramuscular [i.m.]) y el clorhidrato de xilacina (5 mg/kg, i.m.). Asegúrese de que la rata esté completamente anestesiada verificando la falta de un reflejo de pellizco en el dedo del pie.
PRECAUCIÓN: La ketamina es una sustancia controlada que debe manipularse de acuerdo con las pautas institucionales.
NOTA: En este estudio se utilizan inyecciones intramusculares de anestésicos, ya que producen una inducción de anestesia más rápida y confiable que la inyección intraperitoneal. Monitorear continuamente la respiración y la capacidad de respuesta de la rata y proporcionar soporte térmico durante toda la cirugía. - Afeite un área grande de la espalda de la rata (parte superior de la espalda desde justo encima de los omóplatos hasta la mitad de la espalda), así como el área del cuello debajo de la extremidad anterior derecha y el cuero cabelludo.
- Coloque la rata en el área quirúrgica y aplique puralube (lágrimas artificiales) en los ojos. Inyecte un volumen de peso corporal de carprofeno (analgésico) por vía subcutánea (subcutánea [s.c.]) a través de la piel de la parte superior de la espalda, luego inyecte 5 ml de solución de Ringer lactato s.c. a través de la piel de la parte inferior de la espalda.
- Desinfecte todos los sitios quirúrgicos humedeciendo un trozo de gasa estéril con betadine y limpiándolo en el área quirúrgica afeitada con un movimiento circular. Luego repita el proceso con etanol al 70%. Repita este ciclo alterno tres veces.
- Realice la implantación del catéter intravenoso de acuerdo con los protocolos publicados anteriormente.
NOTA: No se utiliza un paño quirúrgico durante esta cirugía para evitar la irritación durante la implantación del catéter. Esterilice todos los instrumentos y equipos antes de usarlos. Use guantes estériles y cámbielos si entra en contacto con alguna superficie no estéril. - Inmediatamente después de los implantes de catéteres, asegure la rata en un marco estereotáxico para realizar inyecciones de virus adenoasociados (AAV).
- Administre una inyección subcutánea (s.c.) de lidocaína al 2% (0,2-0,3 ml) en el cuero cabelludo como anestésico local.
NOTA: No se utiliza anestesia local durante el implante del catéter intravenoso para evitar alteraciones en los resultados quirúrgicos. - Conecte una cánula de inyección de acero inoxidable de calibre 26 a una jeringa Hamilton llena con 1 μL de solución concentrada de AAV: AAV5-hSyn-tdTomato o AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
NOTA: oChIEF es una variante del canal de opsina sensible a la luz azulrodopsina (ChR2), que puede responder a una amplia gama de frecuencias y, por lo tanto, tiene utilidad para los experimentos de depresión a largo plazo (LTD) de baja frecuencia discutidos en este protocolo, pero también para experimentos de potenciación a largo plazo (LTP) de alta frecuencia. La construcción de oChIEF fue donada por el Dr. Roger Tsien y procesada para su envasado y purificación por el Duke Viral Vector Core. Se necesitan al menos 3-4 semanas entre el día de la inyección y el día de la inducción de LTD para permitir una expresión óptima del virus en el núcleo geniculado medial de los terminales axónicos del tálamo (MGN).
PRECAUCIÓN: En general, el AAV se considera un organismo de nivel de bioseguridad 1 (BSL-1), con bajo riesgo de autoinfección a menos que se utilice un virus auxiliar en su producción. Su uso requiere la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), y se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado en todo momento de acuerdo con las pautas institucionales para limitar la exposición innecesaria. - Con un bisturí, haga una incisión de 0,5 mm desde la parte delantera hasta la parte posterior del cráneo y retire el tejido suprayacente para exponer la superficie del cráneo.
- Nivele la cabeza de la rata en el eje anterior / posterior y cero coordenadas estereotáxicas a bregma.
- Taladre tres pequeños agujeros a través del cráneo con una herramienta Dremel equipada con una broca pequeña. Use un destornillador para montar firmemente los tornillos de acero inoxidable (M2x4 965-A2) en su lugar.
NOTA: Los tornillos son necesarios para la unión adecuada del cemento dental y la creación de tapas de cabeza resistentes y duraderas. La posición de los tornillos debe extenderse a lo largo del eje anteroposterior del cráneo y lejos del lugar de inyección de AAV. - Perforar orificios bilaterales para la inyección de AAV según las coordenadas del Atlas del Cerebro de Rata (Watson y Paxinos) para la porción medial del núcleo geniculado medial (MGN); en mm desde el bregma, anteroposterior (AP): -5.4; mediolateral (ML): ±3.0; dorsoventral (DV): -6.6. Baje lentamente las cánulas de inyección (4 mm/min) hasta colocarlas en el MGN. Inyecte una solución concentrada de AAV a una velocidad de 0,1 μl/min.
- Deje la cánula de inyección en su lugar durante 5 minutos después de que se completen las infusiones para permitir la difusión lejos de la cánula y luego retire lentamente la cánula del cerebro.
- Inmediatamente después de las inyecciones de virus, continúe implantando fibras ópticas dirigidas a las terminales MGN-LA.
- Utilice una herramienta Dremel para perforar orificios bilaterales para implantes de fibra óptica dirigidos a la amígdala lateral (en mm de bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Use fórceps para agarrar la férula del implante de fibra óptica y fijarla a los adaptadores estereotáxicos para que se mantengan en su lugar de forma segura.
- Baje lentamente las fibras a una velocidad de 2 mm / min, hasta que la punta de la fibra se asiente en la porción dorsal del LA (dorsoventral [DV]: -7,9 mm).
- Asegure las férulas al cráneo primero con una capa delgada de adhesivo instantáneo Loctite, seguido de cemento dental, y cubra las férulas con manguitos de férula de 1,25 mm de diámetro y cubiertas antipolvo.
NOTA: La elección del adhesivo para asegurar las férulas al cráneo debe ser aprobada por el comité local o institucional de cuidado y uso de animales. La loctita se utiliza para este estudio para asegurar de manera confiable las férulas al cráneo después de prueba y error con múltiples adhesivos; sin embargo, se pueden considerar alternativas disponibles.
- Después de los procedimientos quirúrgicos, aloje a las ratas individualmente y proporcione acceso gratuito a alimentos y agua. Proporcionar atención postoperatoria de acuerdo con las pautas institucionales. Enjuague los catéteres diariamente con solución salina que contenga gentamicina (5 mg / ml) y heparina (30 USP / ml) para mantener la permeabilidad. Al menos 5 días después de la cirugía y 24 h antes del inicio de los experimentos conductuales, la comida restringe a las ratas a ~ 90% de su peso libre.
2. Autoadministración de cocaína en roedores y extinción de palanca instrumental
NOTA: Todos los procedimientos conductuales se llevan a cabo en cámaras de condicionamiento operante estándar, equipadas con dos palancas retráctiles en una pared, una luz de estímulo sobre cada palanca, un generador de tonos, una luz de casa y una bomba de infusión.
- Someter a ratas a sesiones diarias de entrenamiento de autoadministración de cocaína (2 mg/ml) de 1 hora bajo un programa de refuerzo de proporción fija 1 (FR1).
- Coloque las ratas en una cámara operante todos los días y permita que las ratas presionen con palanca. Una pulsación en la "palanca activa" designada (contrapesada entre las palancas izquierda y derecha) da como resultado una infusión de cocaína (1,0 mg/kg/infusión) y una presentación de 10 s de una señal compuesta de luz y tono. Una pulsación en la "palanca inactiva" designada no tiene efectos programados.
- Continúe los experimentos de autoadministración durante al menos 10 días y hasta que las ratas obtengan con éxito al menos 8 infusiones / día durante 3 días consecutivos. El incumplimiento de los criterios de adquisición para el día 20 resulta en la exclusión del estudio.
- Después de cumplir con éxito los criterios de adquisición, someta a las ratas a sesiones de extinción instrumental de 1 h durante 6-10 d.
- Coloque a las ratas en cámaras operantes y permita que las ratas presionen libremente la palanca. Sin embargo, las respuestas tanto en las palancas activas como en las inactivas no tienen consecuencias programadas.
- Haga que las ratas continúen la extinción instrumental diariamente hasta que ocurra un promedio de < 25 pulsaciones de palanca durante dos días consecutivos.
3. Inducción optogenética in vivo de LTD
NOTA: Los experimentos de inhibición optogenética se llevan a cabo 24 h después del último día de extinción instrumental.
- Conecte los latiguillos a un diodo láser azul de 473 nm a través de una junta giratoria suspendida sobre una jaula de carcasa para roedores estándar limpia con la cubierta retirada. Esta configuración permite que los roedores se muevan libremente por la jaula durante la estimulación optogenética.
- Encienda el diodo láser de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento y conéctelo a un generador de pulsos. Ajuste la configuración para que cuando se encienda, la rata reciba 900 pulsos de luz de 2 ms a 1 Hz.
PRECAUCIÓN: Se debe usar protección ocular adecuada en todo momento mientras se opera el láser. - Mida la intensidad de la luz a través del cable de conexión con un sensor de luz. Ajuste la intensidad del láser para que la salida de luz a través del cable de conexión sea de ~ 5-7 mW.
- Coloque a las ratas en una jaula limpia. Retire las cubiertas antipolvo y los manguitos de las férulas, exponiendo las férulas. Conecte los cables de conexión bilateralmente a los implantes de fibra óptica. Permita que las ratas exploren el entorno durante 3 minutos antes de la inducción de LTD.
- Encienda el generador de pulsos para iniciar la estimulación optogenética.
NOTA: Aunque es poco probable, si las ratas experimentan reacciones adversas a la estimulación, el experimento finaliza de inmediato y las ratas son sacrificadas adecuadamente según las pautas institucionales. - Después de la inducción LTD, mantenga a las ratas en la jaula durante 3 minutos y luego colóquelas nuevamente en sus jaulas de origen.
- Para experimentos de control, use el mismo procedimiento de estimulación en ratas que expresan el virus de control AAV5-tdTomato. Para experimentos simulados, conecte un cable de conexión a la fibra óptica de ratas que expresan el virus AAV5-oChIEF, pero no se administra estimulación durante una sesión de 15 minutos.
4. Pruebe el efecto de la estimulación optogenética en la búsqueda de cocaína inducida por señales
- 24 h Después de las estimulaciones optogenéticas in vivo, vuelva a colocar a las ratas en cámaras de acondicionamiento operante. Las ratas se someten a una sesión de reincorporación inducida por señal estándar de 1 hora para evaluar el comportamiento de búsqueda de cocaína.
NOTA: Durante la reincorporación inducida por señales, una respuesta en la palanca activa produce una presentación de 10 segundos de la señal asociada a la cocaína, pero no infusiones de cocaína. - Realice una segunda prueba de restablecimiento al menos 1 semana después de la primera prueba para determinar si la inducción optogenética de LTD da como resultado una supresión a largo plazo de la búsqueda de cocaína