Imágenes de tejido profundo del cerebro de un pez cebra utilizando un microscopio de fluorescencia de tres fotones

Abstract

Fuente: Hontani, Y., et al. Microscopía de fluorescencia de tres fotones de tejido profundo en cerebro intacto de ratón y pez cebra. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra la configuración y ejecución de imágenes de tres fotones en un cerebro de pez cebra anestesiado. El protocolo permite la visualización de tejido profundo de neuronas marcadas con fluorescencia, revelando la actividad y las estructuras neuronales en tiempo real para aplicaciones de investigación en neurociencia.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Imágenes intravitales en el cerebro del pez cebra
   NOTA: Para ubicar correctamente el cerebro del pez debajo de la lente del objetivo, se utiliza una cámara de dispositivo de carga acoplada secundaria (CCD) en el mismo camino que la luz de excitación para imágenes de campo amplio.
   
   1. Configure el microscopio y calibre la potencia.
   2. Coloque un objetivo de bajo aumento (generalmente 4x) en el microscopio.
   3. Coloque la placa de Petri que contiene el pescado y los tubos bajo el microscopio.
   4. Utilice una fuente de luz de diodo emisor de luz (LED) para iluminar la placa de Petri.
   5. Abra el modo Cámara del software de adquisición de imágenes (Figura 1).
   6. Haga clic en En vivo.
   7. Elija el canal A en el lado derecho de la pantalla.
   8. Ajuste la configuración del histograma para ver la imagen con claridad.
      NOTA: Estos deben actualizarse según sea necesario.
   9. Establezca la configuración del motor en el controlador del motor en Base.
   10. Baje el objetivo hasta que el pez sea visible.
       NOTA: Asegúrese de que la lente del objetivo no haga ningún contacto físico con la cabeza.
   11. Coloque el centro de la cabeza del pez en el centro del campo de visión.
   12. Mueve el objetivo hacia arriba y lejos de la cabeza del pez.
   13. Reemplace la lente del objetivo de bajo aumento con la lente del objetivo de alta apertura numérica (NA) para 3PM (microscopía de tres fotones).
       NOTA: La lente de bajo aumento y la lente del objetivo de alta NA no necesitan ser parafocales, pero deben estar lo suficientemente cerca para garantizar que el pez esté dentro del campo de visión de la lente del objetivo de alta NA.
   14. Baje lentamente la lente del objetivo, asegurándose de que el objetivo no haga ningún contacto físico con la cabeza. En el software de la cámara CCD, deje de mover el objetivo cuando la parte superior de la cabeza sea visible. Establezca la ubicación z en 0 μm.
       NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas de aire debajo de la lente del objetivo cuando utilice un objetivo de inmersión en agua.
   15. Apague la fuente de luz LED y cierre la cortina oscura alrededor del sistema.
   16. Configure el software de adquisición de imágenes en modo GG multifotón para imágenes 3P y configure la potencia debajo de la lente del objetivo en menos de 1 mW (con una tasa de repetición de pulsos de ~ 1 MHz).
   17. Cambie el botón de configuración del motor de Base a Objetivo en el controlador del motor.
   18. Apaga las luces de la habitación.
   19. Encienda los tubos fotomultiplicadores (PMT) y abra el obturador de la fuente de excitación 3PM. Asegúrese de que aparezca un contorno del hueso en el canal de señal de fluorescencia debido a la autofluorescencia y en el canal de señal de generación de tercer armónico (THG) debido a THG del hueso (Figura 1C).
   20. Realice imágenes a diferentes profundidades aumentando los niveles de potencia al obtener imágenes más profundas.

Results

Figura 1: Capturas de pantalla representativas para imágenes intravitales en peces (sección 1 del protocolo).) Vista en modo de cámara del software de adquisición de imágenes con la lente del objetivo 4x en su lugar. Las car...

Materials