Imágenes de la migración de células tumorales en tejido de glioblastoma mediante microscopía confocal de barrido de lapso de tiempo

Resumen

Fuente: Parker, J. J., et al. Un modelo de cultivo de corte organotípico de glioblastoma humano para el estudio de la migración de células tumorales y los efectos específicos del paciente de los fármacos antiinvasivos. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra las imágenes de cortes de tejido de glioblastoma que expresan proteína verde fluorescente (GFP) a través de microscopía confocal. Las imágenes de alta resolución se capturan a intervalos constantes para rastrear el movimiento y la dirección de las células tumorales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las pautas del IRB del instituto.

1. Etiquetado de células tumorales a través de retrovirus que expresan proteína fluorescente verde

NOTA: La microscopía de lapso de tiempo para el análisis de la migración de células tumorales requiere un etiquetado fluorescente estable y a largo plazo de las células dentro del cultivo de corte. Se sugiere el uso de retrovirus porque infecta selectivamente las células en división, enriqueciendo así el etiquetado fluorescente dentro de la población de células tumorales en lugar de la microglía u otros tipos de células presentes en la rebanada. La estandarización de la infección sugiere que un título viral de 10⁴ UFC/μL da como resultado una expresión suficiente de proteína verde fluorescente para el seguimiento y análisis de la migración celular. El aumento del título viral, el uso de virus no selectivos (es decir, adenovirus, lentivirus) u otros medios para etiquetar todas las células pueden impedir la identificación de límites celulares claros durante la migración, lo que complica el análisis. El uso de marcadores fluorescentes alternativos se puede utilizar y optimizar según sea necesario.

1. Obtener retrovirus para la infección de cortes tumorales ya sea a través de protocolos estándar5,14 o de una fuente disponible comercialmente. Diluya el sobrenadante viral agregando el volumen apropiado en un medio neuronal no suplementado para lograr un título viral de 10⁴ UFC (unidades formadoras de colonias) / μL.
2. Entre 7 y 10 días de cultivo, infectar los cultivos de corte tumoral de interés con 5 a 10 μL de virus (10⁴ UFC/μL). Coloque el virus suavemente gota a gota sobre la superficie de cada corte de tejido. Disminuye el volumen de sobrenadante agregado si la rebanada flota en la superficie del inserto. Devuelva las placas que contienen cultivos de rodajas a una incubadora.
3. Evalúe los cortes en busca de células tumorales marcadas a partir de las 24 h posteriores a la infección viral. Este retraso variará según la incorporación viral y la cinética de expresión génica de fluorescencia. Para las construcciones virales utilizadas aquí, se requirieron 72 h para observar una señal fluorescente robusta con un microscopio de epifluorescencia estándar.
   NOTA: En raras ocasiones, los cortes muestran una distribución predominantemente periférica de células marcadas viralmente, lo que puede complicar las imágenes confocales. Para evitar esta complicación, intente reducir el grosor de la rebanada y la variación de grosor en la rebanada. Si el cultivo de rodajas tiene una región más gruesa cerca del centro, esto puede impedir la penetración adecuada de nutrientes, limitando así la población de células tumorales que se dividen activamente. Un ensayo cualitativo para detectar esta complicación es la adición de un reactivo colorante de tetrazolio (es decir, MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio)) a los medios de cultivo en rodajas. Las áreas de la rebanada que no se vuelven azules después de agregar el reactivo indican una falta de actividad metabólica y una salud de la rebanada comprometida.

2. Imágenes confocales de escaneo láser de fotón único de lapso de tiempo de la migración de células tumorales

NOTA: Después de confirmar la transducción exitosa y la salud del cultivo, se pueden obtener imágenes de las células en condiciones de control, seguidas de un período igual de imágenes en condiciones de tratamiento. Usando este protocolo, las células fueron rastreadas con éxito durante 12 horas en cada condición. Sin embargo, los períodos más cortos o más largos de imágenes y manipulación ambiental también pueden ser informativos.

1. Cargando el microscopio
   1. Antes de la imagen, coloque 1 ml de medio de rodaja fresca en un plato con fondo de vidrio.
   2. Deje que el medio en el plato con fondo de vidrio se equilibre en una incubadora durante 15 min.
      NOTA: En este punto, se pueden agregar agentes de marcado solubles, como lectinas conjugadas fluorescentemente (es decir, isolectina IB4 para el etiquetado de microglía) o puntos cuánticos conjugados con ligandos, al medio de cultivo de cortes para la identificación de subpoblaciones celulares durante la obtención de imágenes.
   3. Transfiera el inserto a un plato con fondo de vidrio utilizando pinzas estériles en una campana de flujo laminar. Transporta el plato a la platina del microscopio.
   4. Mantenga los cultivos de rodajas a 37 °C y una atmósfera de_CO2 al 5% en una incubadora de platina de microscopio sellada. Utilice la humidificación estéril de H₂O de la cámara de incubación si está disponible para evitar la evaporación excesiva del medio (especialmente importante para experimentos de imágenes más largos).
   5. Utilice un microscopio confocal con un objetivo de aire de 10X a larga distancia de trabajo y excitación láser para fotón único y/o multifotón. nota: Asegúrese de que la lente del objetivo del microscopio proporcione una distancia de trabajo adecuada. Como resultado de la altura adicional de la incubadora de la parte superior de la etapa, el plato con fondo de vidrio y el inserto de cultivo de tejidos, los objetivos de larga distancia de trabajo son críticos.
   6. Asegure la placa inferior de vidrio, retire la cubierta de plástico de la placa de Petri y cúbrala con una membrana permeable al gas.
2. Image Acquisition
   1. Utilice el microscopio para inspeccionar visualmente el corte y localizar un campo adecuado con una densidad adecuada de células tumorales marcadas con fluorescencia entre el borde del corte y el centro. Evite los campos de imágenes en el borde del corte, debido a una mayor susceptibilidad a los desplazamientos del tejido durante la obtención de imágenes. Se pueden emplear arpas de corte de tejido para limitar este cambio.
   2. Utilice software de imágenes en modo de análisis multidimensional para establecer el primer (abajo) y el último (arriba) límites de la pila Z, de modo que todas las posiciones que se van a fotografiar contengan una señal celular fluorescente visible. La obtención de imágenes a través de 150 - 200 μm del corte, con un paso Z constante de 10 μm, proporcionó una resolución adecuada para el seguimiento de las trayectorias celulares (esto se puede ajustar para las necesidades individuales de imágenes).
   3. Si el microscopio tiene una platina motorizada, asegúrese de que se permita el tiempo adecuado para cada adquisición de la pila Z. Establezca el intervalo de tiempo entre adquisiciones para igualar el tiempo de escaneo por posición x número de posiciones para obtener imágenes (es decir, regiones tumorales con imágenes).
      NOTA: Para la excitación simultánea de los fluoróforos verde y rojo, utilice un programa de escaneo de línea láser de doble línea, con excitación simultánea de 488 nm y 633 nm. La longitud de onda de la excitación láser seleccionada variará según las proteínas fluorescentes individuales expresadas.
   4. Mantenga una potencia láser uniforme y configuraciones confocales estenopeicas entre las regiones tumorales visualizadas. Utilice la configuración de potencia láser más baja necesaria para demarcar claramente los cuerpos y procesos de las células tumorales para limitar la fototoxicidad. Las unidades de parámetros de imagen específicas (es decir, la potencia y la configuración estenopeica confocal) variarán según las especificaciones del microscopio y la fuente láser.
   5. Compense la posible evaporación del medio agregando 2 - 3 pasos de pila Z "amortiguadores" en los planos focales que avanzan hacia el objetivo. Esto evita eficazmente que el tejido abandone el rango de adquisiciones de pila Z en el plano vertical.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, menos rojo de fenol	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Supplement (50X),	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Suplemento GlutaMAX	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutamina (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nistatina Suspensión	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10.000 unidades/ml en DPBS, procesado asépticamente, BioReactivo, adecuado para cultivo celular
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Se funde a 65,5 C, permanece fluido a 37 C y se fija rápidamente por debajo de 25 C.
Isolectina GS-IB4 de Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugado	Thermo Fisher (Sondas moleculares)	I32450	Utilizado en medios para marcar Microglía/Macrófagos
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector	Clonetech	632520
Concentrador Retro-X	Clonetech	31455	Resina aglutinante para la concentración sin ultracentrifugación de sobrenadantes virales
pVSG-G Vector	Clonetech	631530	parte del sistema de expresión retroviral universal Retro-X
GP2-293 Células de empaquetado viral	Clonetech	631530	parte del sistema de expresión retroviral universal Retro-X
Pegamento de cianoacrilato (Super Glue)	Sigma-Aldrich	Z105899
Molde de inclusión Peel-A-Way de viscosidad media (cuadrado - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Moldes para incrustación de muestras tumorales
Micro Espátulas de acero inoxidable	Fisher Scientific	S50823	Dobla el instrumento 45 grados en el cuello de la hoja de la cuchara
Pinzas curvadas de punta fina para disección Fisherbrand	Scientific	08-875
Cuchilla de afeitar de un solo filo (Maquinillas de afeitar de seguridad americanas)	Fisher Scientific	17-989-001	El borde de la hoja es de 0.009" de grosor. La cubierta de borde romo ondulado se retira antes de cargarla en el vibratomo.
Leica VT1000 S Vibratomo	Leica Biosystems	VT1000 S
Inserto de cultivo celular de PTFE hidrófilo	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, PTFE hidrófilo, tamaño de poro de 0,4 μm
35 mm Platos con fondo de vidrio	MatTek	P35G-1.5-20-C Manga	20 mm de diámetro de vidrio. Espesor del vidrio del cubreobjetos 1.5
LSM 510 Micoscopio confocal	Zeiss	LSM 510	10x Objetivo de aire (c-apocromático NA 0.45)
Incubadora PECON Stagetop	PeCON Alemania	(Descontinuado)	La incubadora PM 2000 RBT es un producto comprable diseñado para su uso con microscopios Zeiss.

sin sérico Fisher de