Imágenes espontáneas de calcio para la dinámica específica del compartimento en astrocitos

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuente: Bannai, H., et. al., Disección de señales locales de Ca2+ en células cultivadas por indicadores de Ca2+ dirigidos a la membrana. J. Vis. Exp. (2019)

El video demuestra imágenes de fluorescencia para observar la dinámica espontánea del calcio específica del compartimento en los astrocitos mediante el monitoreo secuencial de proteínas sensibles al calcio localizadas en la membrana plasmática y el retículo endoplásmico.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Imágenes de Ca²⁺

Registro de actividades espontáneas de astrocitos que expresan Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f /
NOTA: Sin óptica de división de imágenes, las señales de Ca²⁺ en la membrana plasmática y las que rodean el retículo endoplásmico (RE) se pueden monitorear en la misma célula. Aquí, se describe el registro secuencial de Lck-RCaMP2 (indicador de Ca²⁺ codificado genéticamente dirigido a la membrana plasmática) y OER-GCaMP6f (indicador de Ca²⁺ codificado genéticamente dirigido a la membrana del retículo endoplásmico externo) en los mismos astrocitos. Un objetivo de inmersión en aceite con una apertura numérica superior a 1,3 es muy recomendable para la actividad espontánea de Ca²⁺.
1. Encienda el microscopio, la cámara, la fuente de luz y la cámara de calentamiento del microscopio durante al menos 30 minutos antes de grabar.
2. Monte el cubreobjetos que contiene las células transfectadas con Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f en la cámara de grabación y agregue 400 μL del medio de imagen. Coloque una tapa en la parte superior de la cámara.
3. Elija el conjunto de filtros para GCaMP6f y la fuente de luz (luz de excitación azul, por ejemplo, 470-490 nm; consulte la tabla de materiales). Localice los astrocitos que expresan OER-GCaMP6f.
4. Elija un conjunto de filtros y la fuente de luz para RCaMP2 (luz de excitación verde, por ejemplo, 510-560 nm; consulte la Tabla de materiales) y confirme si Lck-RCaMP2 se expresa en los mismos astrocitos. Evite la exposición prolongada a la fuente de luz para evitar el fotoblanqueo.
5. Grabe imágenes de lapso de tiempo de Lck-RCaMP2 a 2 Hz durante 2 min. Guarde los datos de imágenes en el disco duro.
6. Cambie el filtro establecido a GCaMP6f. Grabe imágenes de lapso de tiempo de OER-GCaMP6f en el mismo campo de visión a 2 Hz durante 2 min. Guarde los datos en el disco duro.
7. Analice los datos utilizando el software de análisis de imágenes.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
18 mm de diámetro cubreobjetos circulares	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Espesor 1, cubreobjetos circulares de 18 mm de diámetro; se pueden utilizar cubreobjetos alternativos.
Cámara para grabación			de imágenes Las siguientes cámaras estaban disponibles para su uso: cámara CCD refrigerada (p. ej., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), cámara EM-CCD (p. ej., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) o cámara CMOS (por ejemplo, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Software			como Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH) y TI Workbench14 (hecho a medida)
Medio de imagen y tampón			Utilice el medio o tampón óptimo para el experimento. Cuando se usa medio, es deseable un medio sin rojo de fenol para reducir la fluorescencia de fondo. Agregue HEPES de 20 mM para mantener el pH fuera de la incubadora de dióxido de carbono.
		fluorescencia invertida	Como IX73 (Olympus) o Eclipse TI (Nikon Instech)
Juego de filtros de microscopio para imágenes			Filtro apropiado para GFP (excitación, 480 ± 10 nm; emisión, 530 ± 20 nm)
Juego de filtros de microscopio para imágenes			Filtro apropiado para RFP (excitación, 535 ± 50 nm; emisión, paso largo de 590 nm)
Sistema			Un sistema de calentamiento para mantener las células a 37 ° C durante la obtención de imágenes. Para evitar la deriva causada por la expansión térmica, se recomiendan sistemas de calefacción que cubran todo el microscopio (por ejemplo, Tokai Hit, Thermobox).
Fuente de luz de microscopio para excitación			Lámpara de mercurio (100 W), lámpara de xenón (75 W), sistema de iluminación de diodos emisores de luz (LED) (por ejemplo, CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., Fuente LED de 4 longitudes de onda; Lumencor, motor de luz SPECTRA X). En caso de bulto de mercurio y lámpara de xenón, use el filtro ND para reducir la intensidad de excitación.
Lente			de microscopio El objetivo de inmersión en aceite Plan-Apochromat con apertura numérica superior a 1,3 es muy recomendable para el registro de la actividad espontánea de Ca²⁺ en neuronas y astrocitos.
Cámara de registro	Elveflow	Ludin Chamber	Esta cámara de registro es para cubreobjetos redondos de 18 mm de diámetro.
Estereomicroscopio			Se utiliza para diseccionar hipocampos. Microscopios estereoscópicos Olympus SZ60 o equivalentes están disponibles.

microscópica de análisis de imágenes Microscopio de GCaMP6f RCaMP2 de calentamiento del microscopio de objetivo

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso