Inducción de la lesión del nervio peroneo en un ratón para estudiar la regeneración de la unión neuromuscular

Resumen

Fuente: Dalkin, W., et al. El método de lesión del nervio peroné: un ensayo confiable para identificar y probar factores que reparan las uniones neuromusculares. J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra un procedimiento quirúrgico para inducir una lesión del nervio peroneo en un ratón para estudiar la regeneración de la unión neuromuscular (NMJ). El procedimiento consiste en exponer el nervio peroné, aplicar presión controlada para inducir lesiones y garantizar que el epineuro permanezca intacto para apoyar la regeneración axonal. Con el tiempo, los macrófagos eliminan los desechos axonales, lo que facilita la reparación nerviosa y el restablecimiento de las NMJ.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Preparación de animales para la cirugía

1. Anestesiar ratones con una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilacina (10 mg / kg) mediante inyección inguinal subcutánea con una jeringa de insulina estéril de 1 ml. La solución portadora contiene una mezcla de solución salina al 0,9%, 17,4 mg/ml de ketamina y 2,6 mg/ml de xilacina. Vuelva a colocar a los animales en jaulas mientras espera que la medicación haga efecto.
   NOTA: Si la dosis de carga no proporciona suficiente anestesia durante la duración del procedimiento, se puede inyectar un 25% adicional de la dosis de carga.
2. Monitoree a los animales después de la inyección para verificar que las frecuencias respiratorias sean constantes y la depresión adecuada de los niveles de excitación. Verifique el nivel de excitación con un pellizco en la pata trasera, que no debería provocar respuesta cuando esté suficientemente anestesiado.
   NOTA: Esto generalmente toma de 3 a 5 minutos para un ratón adulto joven con un promedio de 25 a 30 g. Si el animal aún responde después de 10 minutos después de la inyección, se puede inyectar un 25% adicional de la dosis de carga anestésica.
3. Aplique vaselina y ungüento oftálmico de aceite mineral ligero en los ojos del animal para evitar la sequedad. Saca a los animales de la jaula y colócalos sobre una superficie limpia y plana. Afeite la extremidad trasera deseada desde el pie hasta la pelvis con un cortapelos eléctrico, exponiendo solo la cara lateral de la extremidad.
4. Aplique una depiladora química en el sitio afeitado durante 1 minuto. Retire manualmente el vello con toallitas de laboratorio. Limpie el área depilada con una toallita de laboratorio empapada en etanol.

2. Procedimiento quirúrgico

1. Esterilice los instrumentos quirúrgicos en autoclave u otro método apropiado. Limpie el sitio quirúrgico y la placa quirúrgica con etanol al 80% / H₂O. Desinfecte el sitio quirúrgico con providona. Coloque el ratón en la tabla quirúrgica y alinéelo con las sujeciones de las extremidades. Mantenga la extremidad trasera objetivo en una posición anatómicamente natural con la articulación de la rodilla ligeramente extendida sin rotación interna o externa.
2. Coloque el animal y la tabla bajo el microscopio quirúrgico. Oriente el sitio de incisión adecuado a través de la palpación de puntos de referencia superficiales, específicamente la articulación ósea de la rodilla y la cresta entre los músculos tibial anterior y gastrocnemio.
3. Haga una incisión de aproximadamente 3 cm a través de la piel con un bisturí o unas tijeras de resorte mientras usa pinzas generales para agarrar. Haga la incisión perpendicular al curso subyacente del nervio peroneo común.
4. Continúe la incisión a través de la fascia superficial, exponiendo los músculos bíceps femoral y vasto lateral. Separe estos músculos cortando la fascia profunda de conexión. Un corte de 1-2 cm debería ser suficiente.
5. Retraiga el músculo bíceps femoral caudalmente usando retractores mecánicos, revelando el nervio peroneo común.
6. Trace el nervio proximalmente hasta que se encuentre su intersección con el tendón de la cabeza lateral del músculo gastrocnemio.
   Nota: La exposición puede requerir una manipulación adicional de la piel y el músculo retraídos. Esta intersección se utiliza como un punto de referencia estable para la lesión nerviosa.
7. Sujete el nervio con una pinza fina, alineando las puntas de manera paralela al borde lateral del tendón gastrocnemio. Aplaste el nervio peroneo común aplicando una presión firme y fuerte durante 5 segundos.
8. Corroborar el aplastamiento completo del nervio mediante inspección visual a través del endoscopio quirúrgico. Aparecerá translúcido en el sitio de la lesión. Si se utilizan ratones que expresan proteínas de fluorescencia en axones periféricos, la fluorescencia desaparecerá del sitio de la lesión.
9. Retire los retractores y realinee los músculos en sus posiciones anatómicas. Cierre el sitio de la incisión con 6-0 suturas de seda. 1-3 suturas interrumpidas simples son suficientes. Coloque el ratón en recuperación sobre una almohadilla térmica en una jaula limpia.
10. Monitoree a todos los animales durante 2 horas después de la operación para verificar si respiran y si hay reacciones adversas a la anestesia. Administrar una dosis inicial de buprenorfina 0,05-0,10 mg/kg mediante inyección inguinal subcutánea inmediatamente después de la recuperación de la cirugía. Administre 3 dosis adicionales cada 12 horas durante las próximas 48 horas. Después de la recuperación completa, devuelva a los ratones al centro de cuidado de animales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	3437
Buprenorfina	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Toallitas Kim-Toallitas	Kimtech	34155
Máquina de afeitar eléctrica	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H₂O
10% Proviodina
Jeringa
de 1 ml Tijeras de resorte	Vannas	91500-09
No. 15 bisturí	Braintree Scientific	SSS 15
# 5 Fórceps	Dumont	11252-00
6-0 sutura de seda en aguja de corte inverso	Suture Express	Almohadilla
	Braintree Scientific	AP-R-18.5
sondas moleculares	alfa-BTX conjugadas	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Microscopio estéreo con zoom Olympus		562037192
Microscopio confocal Zeiss 700	Zeiss
Bomba de perfusión peristáltica de flujo variable	Fisher Scientific	13-876-3

de insulina térmica para roedores 752B Alexa 555