Realización de experimentos de microarrays personalizados microARN

Resumen

Un procedimiento sencillo de llevar a cabo experimentos de microarrays de encargo de microARN se describe. Los pasos incluyen el aislamiento de ARN, el ARN y el ADN de referencia el etiquetado, la hibridación de las muestras de microarrays, el escaneado de los microarrays, cuantificar y analizar las señales de hibridación.

Resumen

microARN (miRNA) son una gran familia de ~ 22 nucleótidos (nt) de longitud moléculas de ARN que se expresan ampliamente en las células eucariotas ^1. Genomas complejos codifican por lo menos cientos de miRNAs, que sobre todo inhibir la expresión de un gran número de genes diana transcripcional después de ^{2, 3.} miRNAs control de una amplia gama de procesos biológicos ^1. Además, la expresión alterada miRNA se ha asociado con enfermedades humanas como el cáncer, y los miRNAs pueden servir como biomarcadores de enfermedades y el pronóstico ^{4, 5.} Es importante, por lo tanto, para entender la expresión y función de los miRNAs en diferentes condiciones.

Tres enfoques principales han sido empleados para el perfil de expresión de miARN: PCR en tiempo real, de microarrays, secuenciación y profundidad. La técnica de los microarrays de miRNA tiene la ventaja de ser de alto rendimiento, en general, menos costoso, y la mayoría de las medidas experimentales y el análisis puede ser carrIED en un laboratorio de biología molecular en la mayoría de las universidades, escuelas médicas y hospitales asociados. Aquí se describe un método para realizar experimentos de microarrays de encargo miRNA. Una sonda conjunto miRNA se imprimirán en láminas de vidrio para producir microarrays miRNA. El ARN es aislado utilizando un método o reactivo que preserva las especies pequeñas de ARN, y marcado con un colorante fluorescente. Como control, los oligonucleótidos de ADN de referencia que corresponde a un subconjunto de miRNAs están marcados con un colorante fluorescente diferente. El ADN de referencia servirá para demostrar la calidad de la diapositiva y la hibridación y también se utiliza para la normalización de datos. El ARN y el ADN se mezclan y se hibridó con una diapositiva que contiene sondas de microarrays para la mayoría de los miRNAs en la base de datos. Después del lavado, la diapositiva se escanea para obtener imágenes y cuantificar la intensidad de los puntos individuales. Estas señales en bruto será procesada y analizada, los datos de expresión de los miRNAs correspondiente. MicroArray diapositivas se puede eliminar y se regenera para reducir el costo de microarrays y de mejorar la coherencia de experimentos de microarrays. Los mismos principios y procedimientos son aplicables a otros tipos de experimentos de microarrays personalizados.

Protocolo

1. La impresión de microarrays miARN personalizado

1. Imprimir los microarrays diapositivas con los servicios básicos de microarrays instalaciones de una universidad o una empresa. La calidad de fabricación de microarrays es uno de los factores más críticos para el éxito de un experimento de microarrays. Pruebe algunos de los servicios si es posible. Lo ideal sería imprimir 50-100 diapositivas a la vez, y todas las diapositivas se ven idénticas, con buena separación, los puntos individuales.
2. Para el apoyo de microarrays, que el uso de las diapositivas GAPS II recubiertos.
3. Para las sondas de miRNA, se utiliza el nCode Multi-Especies miARN microarrays sonda Set V2.
4. Disolver todos los oligonucleótidos en 3 x SSC a 10 M y cuádruplemente imprimirlas en las diapositivas. Fijar las diapositivas por la irradiación ultravioleta de acuerdo a las instrucciones de las diapositivas GAAPS II. Etiqueta de la diapositiva con un lápiz de diamante para marcar el área y el lado con las sondas impreso. Almacenar a 22 ° C.

2. Preparación de la muestra

1. Cualquier métodoo reactivo se puede utilizar para aislar ARN, mientras que conserva los pequeños RNAs. Por lo general, el uso Trizol (Invitrogen) para extraer el ARN total, con la cantidad y calidad satisfactoria de preparaciones de ARN, según lo medido por un _{260 nm} y _{280 nm} A lecturas.
2. Para el ARN de etiquetado, mezcla de aproximadamente 25 g de ARN total con 0,5 mg de 5'-UCP-DY547-3 ^"6 en 1 x tampón (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 mM MgCl _2, 10 mg / ml de BSA, el 10% DMSO) que contiene aproximadamente 20 unidades de T4 ARN ligasa 1, suplementado con 10 mM TDT ~ ~ 0.02-0.03 y volumen final de la 10 x T4 ARN ligasa un buffer de ATP.
3. Permitir el etiquetado de proceder en el hielo dentro de un refrigerador durante 2-24 horas. Precipitar el ARN con acetato de sodio 0,3 M y 3 volúmenes de etanol. Para la ligadura de eficiencia y la precipitación, se disuelven en el ARN total de más de 2 mg / ml, y mantener el volumen total de la ligadura de ~ 20 l.
   1. Si es menor de ARN está disponible, la cantidad de ARN de entrada y 5'-UCP-DY547-3 'puede ser reducido.
   2. Si el ARN es muy diluida, añadir soporte como tRNA de levadura para ayudar en la precipitación.
4. Combine y la etiqueta de un total de 1 mg de oligonucleótidos de ADN de referencia correspondiente a un subconjunto de miRNAs de mamíferos utilizando la Ulysis Alexa Fluor 647 Kit nucleicos Etiquetado ácido ⁶ como un control para el proceso de hibridación. Purificar el ADN marcado con una columna Centrisep y guardar en la oscuridad a -20 ° C.

3. Microarrays de hibridación

1. Para utilizar las diapositivas, por primera vez, antes de la hibridación de las diapositivas de una solución de filtrado de 3 x SSC, SDS 0,1%, 0,2% BSA durante 30-60 min a 37 ° C. Sumergirlos en agua unas cuantas veces, y luego en isopropanol. Secar los portaobjetos al uso de una centrífuga con un adaptador para diapositivas a 100 g por 5 min a 22 ° C.

Nota: Usamos Corning cámaras de hibridación de microarrays y Erie Scientific mSeries de Lifterslips para llevar a cabo la hibridación de microarrays.

2. Enjuague la lifterslips en el agua, y luego en etanol, antes del secado en el aire. Coloque una diapositiva dentro de una base de la cámara de microarrays de hibridación, y un lifterslip en la parte superior de la diapositiva. El lifterslip cubrirá el área de la sonda, con sus franjas blancas en contacto con la diapositiva.
3. En la oscuridad, la desaceleración del precipitado, ARN marcado. Lavar una vez con etanol al 70%, y el aire seco de la pastilla. La pastilla debe ser de color rojizo.
4. Prepare una solución de hibridación que contenía 400 mM Na ₂ HPO ₄ pH 7,0, el 0,8% de BSA, 5% SDS, 12% de formamida ⁶ con 1/15-1/100 l de la purificada, con la etiqueta de ADN de referencia (2,4) por cada muestra de ARN. La cantidad de ADN de referencia añadido depende de la cantidad de diferentes oligonucleótidos están etiquetados (2,4). Si hay más de 100, entonces una menor dilución que se necesita.
5. Disolver el precipitado de ARN bien con aproximadamente 60 l de la solución de hibridación.
6. Añadir 20 l de agua para cada uno de los pozos de humidificación en la base de Corning cámara de hibridación de microarrays.
7. Añadir tque mezcla de ARN y el ADN marcado referencia a la diapositiva. Utilice una punta de pipeta fina, toque suavemente el borde de la lifterslip, y permitir que la solución penetre en el espacio entre el lifterslip y deslizarse a través de la succión.
8. Coloque la cámara de hibridación cubierta sobre la base, luego sellar la cámara con clips metálicos.
9. Ponga toda la cámara interior de la bolsa de plástico que viene con el cartucho de cámara de Corning.
10. Coloque la cinta de la cámara (s) dentro de un recipiente con una toalla de papel humedecida, cubra el recipiente con papel plástico y se coloca dentro de 37 ° C húmedo, incubadora de cultivo de células de ~ 24 horas. Estas precauciones (3.6, 3.9, 3.10) asegurarse de que la solución de hibridación no se seque durante la incubación.

4. Después de la hibridación de procesamiento

1. Desmontar los casetes de la cámara de uno por uno. Sumerja una diapositiva y su lifterslip en 2 x SSC a 22 ° C. El lifterslip caerá naturalmente fuera de la diapositiva. Colocarlo en 0,8 x SSC. Lavarlas diapositivas en 0,8 x SSC dos veces, tres veces en 0,4 x SSC, 1-2 minutos en total. Secar los portaobjetos al uso de una centrífuga con un adaptador para diapositivas. Lave la lifterslips con agua y ahorrar para su reutilización posterior.
2. Escaneo de las diapositivas con cualquier escáner adecuado, por ejemplo, la Perkin Elmer 5000 o ScanArray Molecular Devices AXON GenePix 4000B escáner de microarrays. Exploración en longitudes de onda cercana a 547 nm y 647 para obtener los archivos de imagen correspondiente.
3. Utilizar programas como BlueFuse para cuantificar la intensidad de los píxeles de la entrada, los archivos de imagen de 4,2). Inspeccione los puntos individuales con el programa para excluir zonas anormales en los microarrays de mayor consideración. Estas manchas anormales suelen surgir de la impresión de diapositivas o diapositivas pobre manejo después de la hibridación.
4. Utilizar programas como GeneSpring y Excel para el análisis y presentación de datos. Consideraciones generales para la normalización de los datos de microarrays se aplican, lo que está fuera del alcance de este documento.
5. Una vez que las señales satisfactorios se obtienen after 4.3), tira de las diapositivas de microarrays para la reutilización ^7. Enjuague los portaobjetos en agua y luego sumergirse en la pre-calentado, 1 mM NaOH y 0,1 x SSC en un plato de tinción a 62 ° C durante 10-20 minutos. Repita la incubación una vez. Lave el C. desliza un par de veces en el agua hasta por 60 minutos con agitación suave a 22 ° Secar los portaobjetos utilizando una centrifugadora, y almacenar a 22 ° C.
6. Para utilizar las diapositivas regenerado, no es necesario para pre-hibridación de nuevo. Simplemente lavarlos en agua, seguido de isopropanol, y seca las diapositivas justo antes de la hibridación.

5. Los resultados representativos:

En gran medida hemos seguido los procedimientos descritos en el perfil de expresión de miRNA mundial en miles de muestras, es decir, ARN aislado de las muestras de los peces cebra que bajo muchas condiciones diferentes. La figura 1 muestra una imagen escaneada de un microarray de demostrar señales de hibridación muy precisas y fuertes en el diapositivas. El correlati Pearsonen los coeficientes entre repeticiones técnica de hibridación de microarrays se ~ 0.99 ^7, lo que indica una excelente reproducibilidad.

Figura 1 Imagen compuesta de una diapositiva escaneada miARN microarrays después de la hibridación. Manchas rojas resultado de hibridaciones por el ADN de referencia, los puntos verdes de la muestra DY547-RNA marcado, mientras que las manchas amarillas eran de hibridaciones tanto por el ADN y el ARN de las mismas sondas.

Discusión

A pesar de los avances recientes en profundidad las tecnologías de secuenciación, microarrays sigue siendo una opción viable de alto rendimiento para el análisis de ADN y ARN. En comparación con la secuenciación de profundidad, los experimentos de microarrays son más baratos, y un laboratorio típico de la biología molecular puede realizar la mayoría de los experimentos y análisis de datos in-house, que permite flexibilidad y ahorro de tiempo. En el futuro, es probable microarrays bien adaptado para interrogar intensivam...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Artículos	Vendedor	Número de catálogo	Comentarios
NCode Multi-Especies miARN microarrays sonda Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Diseñado en base a la versión 9.0 miRBase (octubre de 2006). Contiene ~ 1140 sin modificar, 34-44 nt largo oligonucleótidos como sondas de gusano, la mosca, el pez cebra, ratón, rata, y miRNAs humanos, y una serie de sondas de control interno, tales como snoRNAs. Las sondas de miRNA son dobletes de las secuencias complementarias de miRNAs maduros, por lo tanto, el tamaño de ~ 44 nt. Para el análisis se puede centrar en los miRNAs de un genoma particular (s) de interés.
Trizol	Invitrogen	15596018	También hemos utilizado enriquecido, pequeña fracción de ARN para el etiquetado, aunque el total de muestras de ARN son más rápidos y más fáciles de preparar y cuantificar y adecuado para las aplicaciones posteriores tales como el análisis de ARNm.
T4 RNA ligase 1	Nueva Inglaterra Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Kit de etiquetado ácido nucleico	Invitrogen	U21660	Este kit o productos similares, puede ser utilizada para etiquetar experimental muestras de ARN o un ARN de control (en lugar de ADN control) también.
5'-UCP-DY547-3 '	Dharmacon	Una medida que se	Pequeña fracción de ARN pueden ser etiquetados de manera similar por la ligadura.
Centrisep columnas	Princeton separaciones	CS-901
GAPSII recubierto de diapositivas	Corning	40004	Otros tipos de diapositivas puede también ser utilizado.
Microarrays de cámaras de hibridación	Corning	2551 o 40080	Otros tipos de cámaras de hibridación y cubreobjetos también debería funcionar. Uso de máquinas de hibridación comercialmente disponibles puede reducir significativamente el tiempo de hibridación, por ejemplo, a ~ 2 horas.
Lifterslips	ªERMO / Erie Científico	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent