Realización de experimentos de microarrays personalizados microARN

Summary

Un procedimiento sencillo de llevar a cabo experimentos de microarrays de encargo de microARN se describe. Los pasos incluyen el aislamiento de ARN, el ARN y el ADN de referencia el etiquetado, la hibridación de las muestras de microarrays, el escaneado de los microarrays, cuantificar y analizar las señales de hibridación.

Abstract

microARN (miRNA) son una gran familia de ~ 22 nucleótidos (nt) de longitud moléculas de ARN que se expresan ampliamente en las células eucariotas ^1. Genomas complejos codifican por lo menos cientos de miRNAs, que sobre todo inhibir la expresión de un gran número de genes diana transcripcional después de ^{2, 3.} miRNAs control de una amplia gama de procesos biológicos ^1. Además, la expresión alterada miRNA se ha asociado con enfermedades humanas como el cáncer, y los miRNAs pueden servir como biomarcadores de enfermedades y el pronóstico ^{4, 5.} Es importante, por lo tanto, para entender la expresión y función de los miRNAs en diferentes condiciones.

Tres enfoques principales han sido empleados para el perfil de expresión de miARN: PCR en tiempo real, de microarrays, secuenciación y profundidad. La técnica de los microarrays de miRNA tiene la ventaja de ser de alto rendimiento, en general, menos costoso, y la mayoría de las medidas experimentales y el análisis puede ser carrIED en un laboratorio de biología molecular en la mayoría de las universidades, escuelas médicas y hospitales asociados. Aquí se describe un método para realizar experimentos de microarrays de encargo miRNA. Una sonda conjunto miRNA se imprimirán en láminas de vidrio para producir microarrays miRNA. El ARN es aislado utilizando un método o reactivo que preserva las especies pequeñas de ARN, y marcado con un colorante fluorescente. Como control, los oligonucleótidos de ADN de referencia que corresponde a un subconjunto de miRNAs están marcados con un colorante fluorescente diferente. El ADN de referencia servirá para demostrar la calidad de la diapositiva y la hibridación y también se utiliza para la normalización de datos. El ARN y el ADN se mezclan y se hibridó con una diapositiva que contiene sondas de microarrays para la mayoría de los miRNAs en la base de datos. Después del lavado, la diapositiva se escanea para obtener imágenes y cuantificar la intensidad de los puntos individuales. Estas señales en bruto será procesada y analizada, los datos de expresión de los miRNAs correspondiente. MicroArray diapositivas se puede eliminar y se regenera para reducir el costo de microarrays y de mejorar la coherencia de experimentos de microarrays. Los mismos principios y procedimientos son aplicables a otros tipos de experimentos de microarrays personalizados.

Protocol

1. La impresión de microarrays miARN personalizado

1. Imprimir los microarrays diapositivas con los servicios básicos de microarrays instalaciones de una universidad o una empresa. La calidad de fabricación de microarrays es uno de los factores más críticos para el éxito de un experimento de microarrays. Pruebe algunos de los servicios si es posible. Lo ideal sería imprimir 50-100 diapositivas a la vez, y todas las diapositivas se ven idénticas, con buena separación, los puntos individuales.
2. Para el apoyo de microarrays, que el uso de las diapositivas GAPS II recubiertos.
3. Para las sondas de miRNA, se utiliza el nCode Multi-Especies miARN m....

Discussion

A pesar de los avances recientes en profundidad las tecnologías de secuenciación, microarrays sigue siendo una opción viable de alto rendimiento para el análisis de ADN y ARN. En comparación con la secuenciación de profundidad, los experimentos de microarrays son más baratos, y un laboratorio típico de la biología molecular puede realizar la mayoría de los experimentos y análisis de datos in-house, que permite flexibilidad y ahorro de tiempo. En el futuro, es probable microarrays bien adaptado para interrogar intensivam.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artículos	Vendedor	Número de catálogo	Comentarios
NCode Multi-Especies miARN microarrays sonda Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Diseñado en base a la versión 9.0 miRBase (octubre de 2006). Contiene ~ 1140 sin modificar, 34-44 nt largo oligonucleótidos como sondas de gusano, la mosca, el pez cebra, ratón, rata, y miRNAs humanos, y una serie de sondas de control interno, tales como snoRNAs. Las sondas de miRNA son dobletes de las secuencias complementarias de miRNAs maduros, por lo tanto, el tamaño de ~ 44 nt. Para el análisis se puede centrar en los miRNAs de un genoma particular (s) de interés.
Trizol	Invitrogen	15596018	También hemos utilizado enriquecido, pequeña fracción de ARN para el etiquetado, aunque el total de muestras de ARN son más rápidos y más fáciles de preparar y cuantificar y adecuado para las aplicaciones posteriores tales como el análisis de ARNm.
T4 RNA ligase 1	Nueva Inglaterra Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Kit de etiquetado ácido nucleico	Invitrogen	U21660	Este kit o productos similares, puede ser utilizada para etiquetar experimental muestras de ARN o un ARN de control (en lugar de ADN control) también.
5'-UCP-DY547-3 '	Dharmacon	Una medida que se	Pequeña fracción de ARN pueden ser etiquetados de manera similar por la ligadura.
Centrisep columnas	Princeton separaciones	CS-901
GAPSII recubierto de diapositivas	Corning	40004	Otros tipos de diapositivas puede también ser utilizado.
Microarrays de cámaras de hibridación	Corning	2551 o 40080	Otros tipos de cámaras de hibridación y cubreobjetos también debería funcionar. Uso de máquinas de hibridación comercialmente disponibles puede reducir significativamente el tiempo de hibridación, por ejemplo, a ~ 2 horas.
Lifterslips	ªERMO / Erie Científico	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent