Desarrollo de una red neuronal de ingeniería de microtejidos utilizando una microcolumna basada en hidrogel

Resumen

Fuente: Struzyna, L. A. et. al., Redes neuronales de ingeniería de microtejidos tridimensionales inspiradas en anatómicas para la reconstrucción, modulación y modelado del sistema nervioso. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el desarrollo de redes neuronales de ingeniería de microtejidos utilizando una microcolumna de hidrogel con un núcleo de matriz extracelular. Los agregados neuronales sembrados se adhieren, extienden las proyecciones y forman redes neuronales estructuradas, lo que contribuye a los avances en el neurodesarrollo y la investigación neuroterapéutica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Desarrollo del hidrogel de agarosa (componente acelular de redes neuronales de ingeniería de microtejidos (micro-TENN))Preparación de la

1. solución de agarosa
   1. Dentro de un gabinete de bioseguridad, prepare los depósitos para las microcolumnas transfiriendo 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco a cada una de las dos placas de Petri de 10 cm. Esterilice las pinzas finas y los microbisturíes con un esterilizador de perlas calientes.
   2. Pesar 3 g de agarosa y transferirla a un vaso estéril dentro del gabinete de bioseguridad. Agregue 100 ml de DPBS para una concentración final del 3% en peso/volumen (p/v). Incluya una barra magnética limpia y cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio.
   3. Con una placa caliente/agitador, caliente el vaso de precipitados a 100 °C y revuelva a 120-200 rpm para disolver completamente la agarosa (la solución pasará de turbia a transparente). Mantenga el calentamiento y la agitación después para evitar la gelificación y cambie la temperatura de calentamiento según sea necesario para evitar quemar la agarosa.
      NOTA: La fabricación con el dispositivo cortado con láser y los tubos capilares se presenta a continuación en las subsecciones 1.2 y 1.3, respectivamente. Continúe con la subsección 1.4 después de terminar los pasos descritos en cualquiera de las subsecciones. Para ambos métodos de fabricación de microcolumnas, agregue la agarosa líquida rápidamente, ya que la agarosa se solidifica rápidamente a medida que se enfría. Al esterilizar con un autoclave en cualquiera de los siguientes pasos, utilice las condiciones estándar aplicadas a la cristalería.
2. Preparación de microcolumnas con un dispositivo de corte por láser
   NOTA: El dispositivo de corte por láser se corta de acrílico transparente con una cortadora láser comercial de CO₂. La fabricación de estructuras y dispositivos mediante corte por láser está bien documentada para una variedad de aplicaciones de ingeniería e investigación. Este molde (Figura 1) consta de una serie de cinco canales cilíndricos, cada uno con un diámetro de 398 μm y una longitud de 6,35 mm. Estas matrices cilíndricas están formadas a lo largo de su longitud por dos piezas: una mitad inferior (longitud: 25,4 mm, anchura: 6,35 mm, altura: 6,0 mm) y una mitad superior (longitud: 31,5 mm, anchura: 6,35 mm, altura: 12,7 mm), como se muestra en las Figuras 1A y 1B, respectivamente. Las dos mitades se pueden sujetar entre sí mediante las tapas anterior y posterior observadas en la Figura 1C (largo: 31,5 mm, ancho: 6,35 mm, alto: 12,7 mm), que cuentan con cuatro orificios de alineación que coinciden con dos orificios cada uno en las piezas superior e inferior y que ayudan a asegurar todas las partes juntas cuando se atornillan. Estas tapas también incluyen cinco orificios, concéntricos a los canales cilíndricos, en los que se pueden insertar las agujas de acupuntura para formar la luz de las microcolumnas.
   1. Esterilice el dispositivo que se muestra en la Figura 1 cubriéndolo con papel de aluminio y esterilizando en autoclave. Ensamble el dispositivo como se muestra en la Figura 1D alineando las tapas anterior y posterior solo con la mitad inferior y asegurando las tres partes con dos tornillos y tuercas # 4-40 (diámetro de rosca: 3,05 mm) en los orificios de alineación inferior.
   2. Introduzca completamente una aguja de acupuntura (diámetro: 180 μm, longitud: 30 mm) en los orificios de la aguja en la tapa anterior o posterior del dispositivo (Figura 1D). Con una micropipeta, vierta suficiente agarosa líquida (~ 1 ml para los cinco canales) en la mitad inferior para llenar completamente cada una de las mitades del canal cilíndrico.
   3. Coloque inmediatamente la mitad superior del dispositivo sobre la mitad inferior y aplique presión hasta que esté firmemente en su lugar para completar los canales cilíndricos (la fricción entre las tapas y la pieza superior mantendrá esta última en su lugar). Espere ~ 5 min a temperatura ambiente después de la adición de agarosa para permitir su gelificación dentro de los canales del dispositivo.
   4. Extraiga manualmente la aguja de cada uno de los orificios de las tapas del dispositivo. Retire los tornillos y separe manualmente las dos tapas y la mitad superior de la pieza de la mitad inferior, donde esta última sujetará las microcolumnas de hidrogel.
   5. Use pinzas finas para quitar suavemente las microcolumnas de los canales en la mitad inferior de la pieza y colóquelas en la placa de Petri previamente preparada que contiene DPBS (paso 1.1.1). Reutilice el dispositivo para otra ronda de fabricación de microcolumnas. Continúe con la subsección 1.4.
3. Fabricación de microcolumnas utilizando tubos capilares
   1. Transferir tubos capilares de vidrio (diámetro: 398,78 μm, longitud: 32 mm) al interior del gabinete de bioseguridad. Rompa manualmente los tubos largos en fragmentos de 2,0 a 2,5 cm e inserte completamente una aguja de acupuntura (diámetro: 180 μm, longitud: 30 mm) en cada fragmento (Figura 2A).
   2. Transfiera 1 ml de agarosa líquida del vaso de precipitados a la superficie de una placa de Petri vacía. Sosteniendo el tubo capilar y la aguja introducida, coloque un extremo del tubo en contacto con el charco de agarosa líquida para llenarlo por acción capilar. Agite el tubo para promover el ascenso capilar.
      NOTA: Llene los tubos capilares con agarosa líquida tan alto como lo permita la acción capilar; Posteriormente, estas microcolumnas se pueden cortar en construcciones más pequeñas según la longitud deseada. El pool de agarosa de 1 ml se usa típicamente para un solo tubo, ya que la agarosa se enfría y gelifica rápidamente, lo que evita una mayor acción capilar.
   3. Cuando el líquido deje de subir, retire el tubo capilar de la piscina y colóquelo horizontalmente sobre la superficie de una placa de Petri. Espere 5 minutos para que el gel de agarosa se asiente dentro de los tubos.
   4. Coloque el pulgar y el índice a cada lado del tubo y presione contra él. Use la otra mano para sacar rápidamente la aguja mientras usa el pulgar y el índice para evitar que la microcolumna se deslice fuera del tubo. Inserte una aguja de calibre 30 en el tubo capilar para empujar lentamente la microcolumna hacia un plato que contenga DPBS (paso 1.1.1).
4. Recorte y esterilización de microcolumnas
   1. Transfiera delicadamente una microcolumna de DPBS a un plato vacío con pinzas finas. Agregue 10 μL de DBPS a la parte superior de la microcolumna con una micropipeta para evitar que se seque. Coloque este último plato debajo de un estereoscopio para obtener orientación visual.
      NOTA: A lo largo del protocolo, el secado o deshidratación de la microcolumna se refiere a la adquisición de una estructura arrugada que se distingue visualmente de la apariencia típica e hidratada de estas construcciones. Las microcolumnas deshidratadas se adhieren firmemente a la superficie de las placas de Petri y no se pueden mover fácilmente, mientras que las construcciones hidratadas tienden a deslizarse por la superficie después de ser manipuladas con fórceps. En la Figura 3A se muestra una imagen de contraste de fase de una microcolumna completamente seca.
   2. Recorte la microcolumna con un microbisturí para acortarla a la longitud deseada (aquí, 2-5 mm). Transportar la microcolumna recortada con pinzas finas a la otra placa de Petri DPBS preparada en el paso 1.1.1.
   3. Repita los pasos 1.4.1 y 1.4.2 para cada microcolumna fabricada.
   4. Esterilice las microcolumnas en las placas de Petri que contienen DPBS bajo luz ultravioleta (UV) durante 1 h. Almacene las placas de Petri a 4 °C antes de la adición de la matriz extracelular (ECM) y el recubrimiento celular.

2. Cultivo de neuronas primarias y método de agregación celular forzada

1. Preparación de la matriz piramidal de micropocillos
   NOTA: Esta sección emplea un molde impreso en 3D que consta de una base cilíndrica (diámetro: 2,2 cm, altura: 7,0 mm) y nueve pirámides cuadradas en la parte superior (longitud lateral: 4,0 mm, ángulo de inclinación: 60°), organizadas en una matriz de 3 x 3, como se muestra en la Figura 1E. El proceso de fabricación aditiva utilizando impresoras 3D disponibles en el mercado está bien documentado. Se puede utilizar un software de diseño asistido por computadora para diseñar el molde. El archivo de diseño resultante se puede convertir digitalmente en una trayectoria de herramienta para una impresora 3D. Cada impresora tiene especificaciones diferentes, y las instrucciones para configurar y operar una impresora 3D varían en consecuencia.
   1. Utilice una broca de 3/32" para perforar 16 agujeros en una matriz de 4 x 4 (longitud lateral: 4 cm, separación de agujeros: 1 cm), centrada en la tapa de una placa de Petri de 10 cm. Dentro de una campana extractora química, use la pieza inferior de la placa de Petri para pesar 27 g de polidimetilsiloxano (PDMS) y 3 g de agente de curado (para una proporción de 1:10). Revuelva con una microespátula para distribuir el agente de manera uniforme.
   2. Cubra el PDMS/agente de curado con la tapa perforada. Conecte un extremo de una manguera al puerto de vacío de la campana extractora e inserte el otro extremo en el vástago de un embudo (diámetro de la boca: 10 cm, longitud del vástago: 3 cm, diámetro del vástago: 1,5 cm).
   3. Haga una abertura con una broca de 3/32" en la parte superior de un bulbo de pipeta de 1 ml e inserte y asegure una punta de micropipeta de 1.000 μl en la abertura (con el extremo puntiagudo hacia arriba). Coloque la bombilla y la punta en la manguera y tire de la manguera hacia arriba hasta que la bombilla selle la manguera en el vástago del embudo.
   4. Coloque el embudo en la tapa del plato perforada y asegure la manguera con un soporte resistente disponible. Abra la válvula de vacío durante 5 minutos para succionar y sacar las burbujas de aire a la superficie.
   5. Cierre la válvula, retire el embudo y golpee la placa de Petri contra la superficie de la campana extractora ~ 3 veces para reventar las burbujas de aire restantes.
   6. Coloque un molde impreso en 3D de pocillos piramidales en cada uno de los pocillos en una placa de cultivo de 12 pocillos, con las pirámides apuntando hacia arriba. Vierta el PDMS / agente de curado encima de los moldes hasta que se llene cada pocillo de la placa. Cubra la placa de 12 pocillos con su tapa y transfiérala a un horno durante 1 hora a 60 °C para que se seque.
   7. Retire con cuidado cada matriz de micropocillos PDMS (Figura 1F) de la placa con una microespátula. Cubra las matrices de PDMS con papel de aluminio y esterilícelas en autoclave. Dentro de un gabinete de bioseguridad, inserte una matriz de micropocillos en cada pocillo de una placa de 12 pocillos (Figura 2B).
2. Aislamiento de neuronas corticales de fetos de rata
   1. Agregue ~20 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a cada una de las cuatro a seis placas de Petri de 10 cm (una para cada tejido disecado) dentro de un gabinete de bioseguridad. Transfiera estos platos a una campana de disección y colóquelos en hielo. Esterilice los instrumentos de disección, como microbisturíes, tijeras y fórceps, con un esterilizador de perlas calientes.
   2. Medio basal de neurona embrionaria precalentado + suplemento sin suero al 2% + 0,4 mM de L-glutamina (denominado "medio de cultivo" en adelante) y tripsina al 0,25% + 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 37 °C. Descongele la desoxirribonucleasa (ADNasa) I colocándola a temperatura ambiente. Prepare 1,5 ml de una solución de 0,15 mg/ml de ADNasa I en HBSS y mantenga la solución en hielo.
   3. Eutanasia a una rata embrionaria de día 18 preñada por inhalación de dióxido de carbono y confirme la muerte por decapitación. Transfiera la carcasa a una campana de disección estéril y colóquela con el lado ventral hacia arriba. Enjuague bien el abdomen con etanol al 70%.
   4. Abra el útero y extraiga los fetos (generalmente ~ 11) de los sacos amnióticos con unas tijeras y transfiéralos con fórceps a una placa de Petri que contenga HBSS frío, como se describe. Coloque un bloque de granito frío (-20 °C) debajo del estereoscopio. Coloque la placa de Petri en la superficie de este bloque frío para conservar la baja temperatura del HBSS durante todo el procedimiento de disección.
   5. Enjuague a los cachorros agitando el HBSS y luego transfiéralos al siguiente plato limpio que contenga HBSS. Con la ayuda del estereoscopio y los instrumentos de disección, retire secuencialmente las cabezas, los hemisferios cerebrales y las cortezas de los fetos y transfiera cada tejido con fórceps a un nuevo plato lleno de HBSS después de cada disección.
   6. Aspire solo las cortezas con una pipeta Pasteur y coloque el tejido en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml. Deseche los otros tejidos disecados. Enjuague las cortezas tres veces agregando y eliminando secuencialmente ~ 5 ml de HBSS con una pipeta serológica. Coloque el tubo sobre hielo cuando no esté en uso.
   7. Transfiera las cortezas con una pipeta Pasteur a un tubo de 15 ml que contenga tripsina-EDTA precalentado (4-6 cortezas por 5 ml de tripsina-EDTA). Agite manualmente el tubo una vez y colóquelo a 37 °C. Invierta el tubo cada 3 minutos para evitar que el tejido se aglutine.
   8. Detenga la exposición a la tripsina después de ~ 10 min retirando el tejido con una pipeta Pasteur y transfiriéndolo a un tubo de centrífuga limpio de 15 ml. Agregue la solución de 0,15 mg/ml de ADNasa I (1,5 ml) al tubo con una pipeta.
   9. Utilice una pipeta Pasteur para romper manualmente los grumos de tejido y luego el vórtice (~30 s) hasta que la solución parezca homogénea y no queden fragmentos de tejido en el líquido. Si no es posible homogeneizar completamente la solución, extraiga los fragmentos insolubles tirando de ellos hacia la punta de una pipeta Pasteur.
   10. Centrifugar la solución celular homogénea obtenida en el paso 2.2.9 a 200 x g durante 3 min. Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no alterar las células granuladas. Añadir 2 ml de medio de cultivo con una pipeta serológica y un vórtice para volver a suspender las células.
   11. Cuente el número de células en la solución preparada en el paso 2.2.10 usando un hemocitómetro; el rendimiento esperado es de 3.0-5.0 x 10⁶ células/hemisferio cortical. Preparar 1 ml o más de suspensión celular en medio de cultivo, con una densidad de 1,0-2,0 x 10⁶ células/ml.
3. Formación de agregados celulares neuronales
   1. Con una micropipeta, agregue 12 μL de la suspensión celular de 1.0-2.0 x 10⁶/mL en cada micropocillo de la matriz PDMS (que se colocó en la placa en el paso 2.1.7).
      NOTA: La concentración celular se puede ajustar según el diámetro interno de la microcolumna y el tamaño deseado del agregado celular. ya que las concentraciones más altas producen agregados más grandes.
   2. Centrifugar la placa a 200 x g durante 5 min para forzar la agregación de células en el fondo de los micropocillos (Figura 2B). Agregue con cuidado ~ 2 ml de medio de cultivo en la parte superior de cada matriz de PDMS para cubrir todos los micropocillos sembrados, teniendo cuidado de no perturbar las células agregadas.
   3. Incubar la placa durante 12-24 h a 37 °C y 5% de CO₂.

3. Desarrollo del componente celular de la fabricación del núcleo de ECM de micro-TENN

1. 1. Después de la incubación de agregados, agregue colágeno tipo I y laminina al medio de cultivo (para una concentración de 1 mg / ml cada uno) en un tubo de microcentrífuga para preparar la solución de ECM. Realice los pasos 3.1.2-3.1.4 a temperatura ambiente, pero mantenga el tubo con ECM en hielo cuando no esté en uso para evitar la gelificación prematura.
      NOTA: El gasto típico es de 4 μL de solución de ECM para cada microcolumna (longitud: 5 mm, ID: 180 μm).
   2. Ajuste el pH de la solución de ECM transfiriendo 1-2 μL a papel tornasol para verificar el pH inicial, agregando 1 μL de hidróxido de sodio (NaOH) 1 N y/o ácido clorhídrico 1 N (HCl) a la ECM, según sea necesario, y repitiendo hasta que el pH sea 7.2-7.4. Garantice la homogeneización de la solución ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo evitando la formación de burbujas de aire.
   3. Transfiera las microcolumnas con pinzas esterilizadas de las placas en el paso 1.4.3 a placas de Petri vacías de 35 o 60 mm. Trabaje en 4-5 microcolumnas a la vez para evitar la deshidratación. Conecte una punta de 10 μl a una punta de 1.000 μl a una micropipeta. Usando el estereoscopio como guía visual, coloque la punta en un extremo de las microcolumnas y succione para extraer DPBS residual y burbujas de aire del lumen.
   4. Extraiga rápidamente 4-5 μL de ECM en una micropipeta. Observando bajo un estereoscopio, coloque la punta de la micropipeta en uno de los extremos de las microcolumnas y descargue suficiente ECM para llenar el lumen. Confirme la ausencia de burbujas de aire en la luz, ya que pueden inhibir el crecimiento axonal a través de la MEC. Si existen burbujas de aire, retire el ECM, como se explica en el paso 3.1.3, y vuelva a agregar el ECM.
   5. Para evitar la deshidratación, agregue ~ 2 μL de ECM alrededor de cada microcolumna. Incubar las microcolumnas de hidrogel/ECM en las placas de Petri a 37 °C y 5% de CO₂ durante 25 min. Proceda a la siembra celular inmediatamente después de la incubación.
      NOTA: El período de incubación en el paso 3.1.5 está destinado a dar tiempo para la polimerización del colágeno y la laminina dentro de las microcolumnas.
2. Siembra de células neuronales en las microcolumnas
   NOTA: Para cambiar el medio de cultivo de los agregados transducidos, incline la placa, use una micropipeta para eliminar el medio que se acumula en la pared del pocillo y luego agregue lentamente ~ 1 ml contra la pared (para evitar perturbar los agregados en los micropocillos piramidales). Repita este cambio de medio por segunda vez.
   1. Después del período de incubación en el paso 3.1.5, transfiera aproximadamente 10-20 μL de medio de cultivo a dos áreas libres en las placas de Petri que contienen las microcolumnas. Utilice una micropipeta para transferir individualmente los agregados a la placa de Petri que contiene las construcciones y muévalos con fórceps a uno de los pequeños grupos de medio de cultivo para preservar la salud celular.
   2. Mientras observa bajo un estereoscopio, inserte un agregado en cada extremo de las microcolumnas para micro-TENN bidireccionales o en un extremo para una arquitectura unidireccional (según lo desee) usando fórceps. Confirme la colocación de los agregados dentro de las microcolumnas utilizando el estereoscopio. Use fórceps para mover las microcolumnas sembradas al otro pequeño grupo de medio de cultivo para evitar la deshidratación y preservar la salud agregada.
   3. Incubar a 37 °C y 5% de CO₂ durante 45 min para permitir que los agregados se adhieran a la ECM. Verifique que los agregados permanezcan en los extremos de las microcolumnas utilizando el estereoscopio; Vuelva a introducir los agregados celulares y repita el paso de incubación según sea necesario.
   4. Inundar cuidadosamente las placas de Petri que contienen las micro-TENN con medio de cultivo (3 o 6 ml para una placa de Petri de 35 o 60 mm, respectivamente) con una pipeta serológica. Coloque las placas en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ para cultivo a largo plazo.
   5. Realice cambios de medio medio cada 2 días con medio de cultivo. Retire con cuidado la mitad del medio viejo con una pipeta y utilice el estereoscopio como guía visual para evitar la succión de las micro-TENN. Reemplácelo agregando lentamente un medio fresco precalentado con una pipeta.

Resultados

Figura 1: Planos del dispositivo de fabricación de microcolumnas cortado con láser y el molde de micropocillos piramidales impreso en 3D para la agregación celular. (A)-(B) Plano e imagen de las mitades inferior y superior de la matriz de canales cilíndri...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Laser cutter	Sistemas láser universales	PLS4.75	Se utiliza para fabricar el molde de microcanales cortado con láser.
Dispositivo de fabricación de microcolumnas cortado con láser	Hecho a medida	--------------	Póngase en contacto con nuestro grupo de investigación si está interesado. Dimensiones y planos proporcionados en el manuscrito.
Tornillos	--------------	--------------	#4-40 con un diámetro de rosca de 3,05 mm
Tuercas	--------------	--------------	#4-40 con un diámetro de rosca de 3,05 mm
Aguja de acupuntura (180 μm de diámetro)	Lhasa medical	sj.16X40	El diámetro puede variar según el tamaño deseado para el lumen de la microcolumna.
Placa de Petri	Fisher	08772B
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)		Invitrogen
	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Tubo capilar (398 μm de diámetro)	Fisher	21170D	El diámetro puede variar según el tamaño deseado para la carcasa de la microcolumna.
Placa calefactora	Fisher	SP88857200
Barra magnética	Fisher	1451352
Micropipeta	Sigma	Z683884-1EA Aguja
calibre 25 mm	Fisher	14-826-49
Microbisturí	Roboz quirúrgica	RS-6270
Tijeras	de ciencia	fina14081-09
Fórceps	World instrumentos de precisión 501985
Esterilizador de perlas calientes	Estereoscopio Sigma	Z378550-1EA
	Nikon		SMZ800N Se utiliza para todos los pasos de disección y para la fabricación de micro-TINN.
Cola de rata tipo I colágeno	Corning	354236	Mantener a 4 ºC y retirar solo cuando sea necesario. Use hielo para preservar su temperatura cuando esté en uso.
Tubo de microcentrífuga	Fisher	02-681-256
Laminina de ratón	Corning	354232	Mantener a 4 ºC y retirar solo cuando sea necesario. Use hielo para preservar su temperatura cuando esté en uso.
Medio neurobasal	Invitrogen	21103049	Medio basal para el cultivo de células neuronales prenatales y embrionarias. Conservar a 4ºC y calentar a 37 ºC antes de usar.
Hidróxido de sodio (NaOH)	Fisher	SS2661
Ácido clorhídrico (HCl)	Fisher	SA48-1
Papel tornasol	Fisher	09-876-18
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)	Invitrogen	14170112	Almacenar a 4 ºC.
Tripsina-EDTA	Invitrogen	al	conservar a -20 ºC y calentar a 37 ºC antes de su uso.
Desoxirribonucleasa pancreática bovina (DNasa) I	Sigma	10104159001	Almacenar a -20 ºC y calentar a 37 ºC antes de su uso.
Suplemento B-27	Invitrogen	12587010	Suplemento añadido al medio neurobasal para el cultivo de neuronas hipocampales y corticales. Conservar a -20 ºC y calentar a 37 ºC antes de su uso.
L-glutamina	Invitrogen	35050061	Conservar a -20 ºC y calentar a 37 ºC antes de su uso.
Sprague Dawley día embrionario 18 ratas	Charles River	Cepa 001
Pipeta Pasteur	Fisher	22-042816
Tubo de centrífuga de 15 ml	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrífuga	Fisher	05-413-115
Hemocitómetro	Fisher	02-671-6
Objet30 Impresora 3D	Stratasys	--------------	Se utiliza para fabricar los moldes de micropozos piramidales.
Molde de pozo piramidal impreso en 3D	Hecho a medida	--------------	Póngase en contacto con nuestro grupo de investigación si está interesado. Dimensiones y planos proporcionados en el manuscrito.
Polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado	Fisher	NC9285739	Viene como kit con elastómero y agente de curado. Úselo dentro de una campana extractora de productos químicos.
Embudo	Fisher	10-348C
1 ml de bulbo de pipeta	Sigma	Z509035
Microespátula	Fisher	S50821
Placa de cultivo de 12 pocillos	EMESCO	1194-353043
Horno	Fisher	11-475-154
Incubadora	Fisher	13 998 076
Microscopio Eclipse Ti-S	Nikon	--------------	Se utiliza para tomar las imágenes de contraste de fase. Con adquisición de imágenes digitales mediante una cámara QiClick interconectada con el software de investigación básica Nikon elements (4.10.01).

Pipeta serológica desechable de poliestireno 14200075 Herramientas 0,25% 25200056