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1. Fluoresceína dextrano y GSL I-isolectina B 4 inyecciones vena facial para etiquetar vasculatura embrionaria
- Prepare FITC-dextrano (50ug/mL) en tampón fosfato salino (PBS) o GSL 1 - isolectina B 4 (20ug/200uL) en PBS en un tubo Eppendorf 1,5 ml y calentar a 37 º C. Añadir 100uL de acciones de 1,25 Fast Green / PBS a la solución de FITC-dextrano (volumen total de 1 ml) y 180uL de acciones de 1,25 Fast Green / PBS a la GSL 1 - isolectina B 4 (200uL volumen total), por lo que la solución es visiblemente azul.
- Diseccionar E14.5 E18.5-embriones y el saco vitelino juntos, dejando el tallo alantoideo (arteria y vena umbilical) se mantienen intactas.
- Transferencia de embriones a un nuevo plato de petri (60 x 15 mm) y sumérgelas en PBS a temperatura ambiente.
- La posición del embrión para proporcionar una vista sagital de la cabeza / cara. El uso de micro pinza de disección para agarrar suavemente el embrión en la cabeza.
- Utilizando una aguja 30G, se inyectan 50 ul FITC-dextrano (50ug/mL) o GSL 1 - isolectina B 4 (20ug en 200uL PBS) en la vena facial, apuntando la aguja hacia la parte posterior de la cabeza.
- Cuando el medio de contraste es visible en la vena umbilical, retire la aguja y por separado el embrión del tallo alantoideo (arteria umbilical y la vena).
- Después de las inyecciones, permiten embrión a permanecer en PBS a temperatura ambiente durante 2-3 minutos para que el colorante circula por todo el embrión.
2. Todo el montaje análisis de la vascularización cutánea
- Después de permitir que el medio de contraste a circular por todo el embrión, extraer muestras de la piel de las regiones de las extremidades, espalda y estómago, etc 8,9.
- Lavar la piel de la muestra en PBS frío, y fijar en el 4% PFA / PBS durante 2 horas 8,9. Lavar 3 veces durante 10 minutos cada uno en un vial de 4 ml claro con 2 ml de PBS frío.
- Coloque la muestra de piel en un microscopio de diapositivas y añadir 100 ml de montaje de los medios de comunicación en cada diapositiva y una cubierta de vidrio.
- Permitir que se sequen en un área de almacenamiento en la oscuridad.
- Continúe con el Paso sección 'Adquisición de imágenes "2.
3. Multi-color etiquetado de timo y los vasos sanguíneos del corazón y las células perivasculares de cryosections (Continúa de la Sección 1, Paso 7)
- Embrión de todo 'Flash congelar en nitrógeno líquido. Los embriones se pueden y se almacenan a -80 ° C hasta su análisis.
- Por otra parte, diseccionar el timo, el enjuague en PBS 4 ° C, y fijar en 2 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) / PBS durante 2 horas. Lavar 3 veces durante 10 minutos en PBS frío, lugar thymi en octubre, y congelar y almacenar hasta su uso a -80 ° C.
- Para muestras criostáticas, se extendió en octubre 'block' y una sección de montaje en el embrión o los órganos diseccionados / tejidos para el corte.
- Cortar el tejido congelado en 10 micras de espesor y se acumulan en las diapositivas.
- Fix secciones en acetona durante 5-10 minutos. Lavar 3 veces en TBS frío.
- Bloque en el burro 10% de suero / TBS en una cámara húmeda a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones de una hora durante la noche-con 100 l de anticuerpos primarios en una cámara húmeda a 4 ° C: en este ejemplo, el uso de rata anti-CD31 de ratón (1:100) al endotelio etiqueta, y de cabra anti-ratón PDGFR-β (1:100) para marcar a las células perivasculares. Es útil para cubrir las diapositivas individualmente cortar tiras Parafilm para asegurarse de que el anticuerpo se extienda uniformemente por toda la sección.
- Después de la incubación con el anticuerpo primario, lave las secciones 3 veces en TBS frío. Incubar con 100 l de anticuerpos secundarios apropiados durante 30 minutos como mínimo.
- Lavar 3 veces en TBS frío. Añadir 100 ml de montaje de los medios de comunicación en cada diapositiva y una cubierta de vidrio.
- Permitir que se sequen en un área de almacenamiento en la oscuridad.
- Pase a la sección 'Adquisición de imágenes ".
4. Multi-color de etiquetado de la vasculatura del timo y células perivasculares de las secciones vibratome (Continúa de la Sección 1, Paso 7)
- Diseccionar los lóbulos del timo del embrión y enjuague con PBS frío.
- Fix timo en el 4% PFA / PBS a temperatura ambiente durante 2 horas.
- Se lavan con PBS-Triton X (0,15%) 3 veces, 10 minutos y thymi lugar en un cartucho de plástico y se sumergen en el 4% de baja fusión de agarosa / PBS (~ 4 ° C). El timo debe estar en contacto con la parte inferior del cartucho.
- Permitir agarosa para solidificar en el hielo (3-5 minutos). Use una hoja de afeitar para cortar el exceso de agarosa. Añadir cola en el bloque de vibratome y adherirse al bloque de la muestra.
- Añadir PBS frío a baño de agua vibratome hasta que la muestra y la hoja están inmersos.
- Ajustar la velocidad y la amplitud (de gran amplitud y baja velocidad moderada es ideal para suaves secciones del timo). La amplitud debe ser reducida si las secciones romper debido a la agitación en exceso.
- Corte secciones de 50 um.
- Usando un pincel, recoger las secciones en una microplaca de 24 pocillos en PBS frío.
- Secciones de bloque en 500 l de suero de burro del 10% en PBS-Triton X (0,15%) durante 30 minutos.
- Secciones se incuban durante 8 horas o toda la noche con el anticuerpo primario, tales como anti-CD31 y anti-PDGFR β-, En una cubierta de 24 pocillos de microplacas.
- Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) sobre un total de 8 horas a 4 ° C.
- Secciones de bloque en el suero de burro del 10% en PBS-Triton X (0,15%) durante 30 minutos.
- Incubar las secciones de 8 horas a la noche a 4 ° C con anticuerpos secundarios apropiados.
- Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) sobre un total de 8 horas a 4 ° C.
- Fijar de nuevo las muestras en el 4% PFA / PBS durante 30 minutos en hielo.
- Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) más de 30 minutos en hielo.
- Deshidratar las muestras a través de una gradual MeOH / PBS Triton X-series: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH, MeOH y 100% a los 10 minutos para cada paso. Reemplazar el 100% de MeOH con MeOH fresco después de 10 minutos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
- En un recipiente de vidrio, mezclar Babb (alcohol bencílico: benzoato de bencilo) en una proporción de 1:2. Combine Babb con MeOH para una concentración final del 50% Babb y el 50% MeOH. Incubar la muestra en Babb: MeOH durante 10-15 minutos.
- Transferir la muestra a un recipiente de vidrio con 100% Babb y se incuba durante 10-15 minutos o hasta que sean borrados, a temperatura ambiente.
- Llena de diapositivas depresión (0,7 mm de profundidad) con Babb fresca 100% y de transferencia de muestras a un lado. Añadir cubierta de vidrio (No. 1.5) y el sello con 2-3 capas de esmalte de uñas. Permita que el esmalte de uñas para endurecer en la oscuridad a temperatura ambiente, luego almacenar la muestra a 4 ° C.
Nota: Las diapositivas deben estar completamente cerrados antes de la adquisición de la imagen confocal. Las imágenes deben ser adquiridas en 12-24 horas, como los tintes fluorescentes pueden desaparecer en Babb. - Pase a la sección 'Adquisición de imágenes ".
5. De adquisición de imágenes
- Imagen 10 micras secciones congeladas con un microscopio confocal con el Plan-Apochromat 20X/0.8 objetivo (512 x 512 píxeles) con 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectina B 4), 543 - y 633-nm líneas láser.
- Adquirir confocal z-secciones de la piel y montaje de todo 50 micras de agarosa embebido en secciones con el Plan-Apochromat 10X/0.4 objetivo (512 x 512 píxeles) con 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectina B 4), 543 -, y 633-nm líneas láser. De serie Z-secciones deben ser recogidos de forma secuencial en un micrones para cada canal correspondiente.
- Reconstruir serie Z-secciones usando Zeiss Axiovision 4,6 u otro software de análisis de imagen.
6. Los resultados representativos:
Etiquetado de la eficiencia de la vasculatura embrionarias es crucial para la evaluación de los defectos de los vasos sanguíneos en embriones de ratones. La figura 1 muestra un etiquetado específico de los vasos sanguíneos del timo E16.5 (1A-B) y el etiquetado de cooperación con CD31 (1B), además de la tinción de los ventrículos derecho e izquierdo (1E-F), respectivamente. El GSL I-isolectina B 4 protocolo para cryosections como se describe en las secciones 1, 3 y 5 se utilizó en estos experimentos. Todo el montaje de etiquetado de la red de vasos sanguíneos en la piel E16.5 ratones, utilizando los protocolos descritos en las secciones 1, 2 y 5 se muestra en la Figura 1C-D.
Figura 1 Leyenda. FITC GSL I - isolectina B 4 inyecciones en la vena facial E16.5 embriones de ratón. criosección a. de timo embrionario después de la inyección. b. Fusión de CD31 co-etiquetado con isolectina B 4. c. y d. Todo el montaje de la inyección de la piel embrionaria vasculatura siguiente. e. y f. criosección de corazón embrionarias e. (derecha ventrículo) f. (ventrículo izquierdo) después de la inyección.