Un ensayo funcional de sangre completa para medir la viabilidad de las micobacterias, usando Reporter-Gene Tagged BCG o M. tuberculosis (BCG Lux / M. Tb Lux)

Resumen

Se describe un método alternativo para la enumeración de las micobacterias In vitro, Que utiliza el reportero de genes etiquetados micobacterias en lugar de unidades formadoras de colonias (UFC). "Survival" de los organismos así como el anfitrión de respuesta se miden los marcadores simultáneamente, proporcionando un bajo costo, un sistema versátil y funcional para el estudio de las interacciones hospedante / patógeno en el contexto de la tuberculosis.

Resumen

Ensayos funcionales han desempeñado un papel clave en la medición de la inmunogenicidad de una vacuna administrada. Esto se expresa convencionalmente como suero títulos bactericidas. Los estudios de títulos bactericidas séricos en respuesta a las vacunas infantiles nos han permitido desarrollar y validar niveles de corte de la respuesta inmunitaria protectora y como corte-offs son de uso rutinario. No hay tales pruebas se han llevado adelante en la evaluación de rutina de las vacunas que inducen principalmente inmunidad mediada por células en forma de respuestas de células T efectoras, tales como vacunas contra la tuberculosis. En el modelo animal, el rendimiento de un candidato a vacuna dada es evaluada en forma rutinaria en los ensayos normalizados bactericida, y todos los actuales nueva vacuna contra la tuberculosis, los candidatos han sido sometidos a este paso en su evaluación antes de la fase 1 de ensayos humanos. La evaluación de la inmunogenicidad y por lo tanto, la probabilidad de eficacia protectora de la novela de vacunas contra la tuberculosis idealmente deben ser sometidos a un similar paso a paso la evaluación de los modelos humanos ahora, incluyendo las mediciones en los ensayos de bactericidas.

Ensayos bactericidas en el contexto de la investigación sobre la tuberculosis vacuna ya están bien establecidos en los modelos animales, donde se aplican a la pantalla de vacunas potencialmente prometedores. La reducción de la carga bacteriana en las funciones de varios órganos como la principal lectura de la inmunogenicidad. Sin embargo, estos ensayos no han sido incorporados en los ensayos clínicos de nuevas vacunas contra la tuberculosis hasta la fecha.

Aunque todavía hay incertidumbre sobre los mecanismos exactos que llevan a la muerte de las micobacterias interior de los macrófagos humanos, la interacción de los macrófagos y las células T con micobacterias es claramente necesario. El ensayo se describe en este documento representa una generación nueva de ensayos bactericidas que permite a los estudios de estos componentes celulares claves con todos los demás factores humorales y celulares presentes en la sangre entera sin hacer suposiciones acerca de su contribución individual relativa. El ensayo descrito por nuestro grupo utiliza pequeños volúmenes de sangre total y ya ha sido empleado en los estudios de adultos y niños en las zonas endémicas de TB-configuración. Hemos demostrado la inmunogenicidad de la vacuna BCG, un mayor crecimiento de las micobacterias en pacientes VIH-positivos, así como el efecto de la terapia anti-retroviral y la vitamina D en la supervivencia de micobacterias in vitro. Aquí un resumen de la metodología, y presentar nuestros datos de reproducibilidad utilizando este modelo relativamente simple, de bajo costo y el campo de usar.

Nota: Las definiciones / abreviaturas

BCG lux = M. bovis BCG, cepa de Montreal, transformada con pSMT1 plásmido lanzadera que lleva los genes luxAB de Vibrio harveyi, bajo el control de la micobacteria GroEL (hsp60) promotor.
UFC = unidades formadoras de colonias (una medida de la viabilidad de micobacterias).

Protocolo

1. Preparación de las acciones de BCG reportero lux micobacterias

1. Crecer BCG lux (M. bovis BCG cepa Montreal transformadas con el plásmido lanzadera pSMT1) con agitación a 200 rpm hasta mediados de la fase logarítmica en caldo Middlebrook 7H9 que contenía 0,2% de glicerol, 0,05% entre 80 y 10% de enriquecimiento ADC.
2. Prepare 1 ml de una dilución de 1:10 de la BCG cultura lux en PBS estéril en un tubo luminómetro (900μl PBS + 100μl BCG cultura lux) por duplicado.
3. Carga del tubo que contiene N-decil aldehído (sustrato de la enzima luciferasa) en la parte posterior de la máquina y asegurarse de que la tapa esté asegurada y los tubos en su lugar.
4. Primer luminómetro inyector con el sustrato a través del programa principal, ajustado a inyectar 100 UCL x 3 en cada uno de 3 tubos de cebado vacío colocado en el luminómetro.
5. La carga de los 2 tubos en el luminómetro y tomar las lecturas a través de un programa conjunto de inyectar 100 UCL de sustrato en cada tubo y leer durante 20 segundos en intervalos de 1 seg.
6. Cuando la acción ha llegado a 1x10 ⁸ RLU / ml a 2x10 ⁸ RLU / ml (esto tarda unos 3-4 días de crecimiento), añadir un volumen igual de glicerol estéril al 30% a la cultura en un tubo de 50 ml de halcón y mezclar suavemente.
7. Alícuota de 1,5 ml los volúmenes de 2 ml en un recipiente etiquetado con tapón de rosca microtubo y almacenar a -80 ° C.

2. La determinación de valores de RLU / UFC correlación y el contenido de las alícuotas

1. Añadir 15 ml de medio Middlebrook 7H9 cultura con un 10% suplemento ADC a un matraz Erlenmeyer de 200 ml con un tapón ventilado.
2. Añadir 15μl de higromicina y 30μl de 20% de Tween.
3. Saca una ampolla de la vacuna BCG lux del congelador y descongelar a temperatura ambiente (TA) en el gabinete de seguridad. Añadir el contenido del vial en el medio y apretar la tapa.
4. Incubar con agitación a 200 rpm a 37 ° C durante 4 días.
5. En cada día, conforman serie de 10 diluciones (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 y 1:100.000) para la determinación de UFC.
6. Establecer las mismas diluciones en paralelo y duplicado para determinar la luminiscencia (véase la parte 1.2 hasta 1.6).
7. Prepare dos de 3 compartimientos placas de agar Middlebrook 7H11 (1 l de medio líquido que contiene 0,5% de glicerol, 10% de suplemento OADC, 1 ml de Tween 20% y 1 ml de higromicina).
8. Placa de 100μl de cada dilución en un segmento de cada placa con crucetas por separado, la distribución del líquido por igual a través de la cámara individual.
9. Sellar cada placa con parafilm, colóquela en una bolsa de plástico estéril, selle con cinta de autoclave, y se incuba a 37 ° C durante 2 semanas con las tapas hacia abajo.
10. Inspeccione periódicamente hasta UFC aparecen (2-3 semanas).
11. Para contar las colonias, quitar las placas de la incubadora y el lugar en un contador de colonias. Calcular la media para cada dilución de las placas duplicadas.
12. Calcular la razón de RLU / UFC utilizando equivalente RLU y el recuento de UFC por cada dilución. La relación debe ser de entre 3 y 5 RLU / UFC.

3. Preparación de la vacuna BCG cultura lux para su inoculación en sangre total

1. Añadir 15 ml de medio Middlebrook 7H9 cultura con un 10% suplemento ADC a un matraz Erlenmeyer de 200 ml con un tapón ventilado.
2. Añadir 15μl de higromicina y 30μl de 20% de Tween.
3. Saca una ampolla de la vacuna BCG lux del congelador y descongelar a temperatura ambiente en el gabinete de seguridad. Añadir el contenido del vial en el medio y apretar la tapa.
4. Incubar con agitación a 200 rpm a 37 ° C durante 2 a 4 días.
5. Prepare 1 ml de una dilución de 1:10 de la BCG cultura lux en PBS estéril en un tubo luminómetro (900μl PBS + 100μl BCG cultura lux) por duplicado.
6. Primer luminómetro con el sustrato (como se describió anteriormente), suavemente vórtice de los 2 tubos y carga en el luminómetro y tomar las lecturas (como se describió anteriormente).
7. Use esta lectura para diluir por la cultura en PBS para dar un equivalente de 7x10 ⁶ RLU (esto le dará un inóculo de aproximadamente 2x10 ⁵ UFC / ml de sangre y una relación de BCG a los monocitos de aproximadamente 1:1, asumiendo un recuento de monocitos de de 2x10 ⁵ 4x10 ⁵ de monocitos por ml de sangre).

4. Preparación de sangre entera

1. Tomar de 3 a 5 ml de sangre venosa en un tubo con heparina sin conservantes.
2. La transferencia de la sangre a un tubo de 50 ml halcón y diluir con un volumen igual de RPMI 1640 con HEPES 25 mM de glutamina y (no penicilina / estreptomicina).
3. 900μl alícuota de sangre diluida por triplicado en tubos estériles bijou para cada momento (6 tubos en total: 3. 0hrs de 96 horas y 3 para Establecer tubos adicionales para los puntos de tiempo adicional, si es necesario.
4. 900μl alícuota del medio Middlebrooks cultura 7H9 con ADC de 10% de suplemento higromicina + 50μg/ml (el mismo medio que utiliza para la cultura de la BCG lux) por duplicado para los controles de crecimiento.
5. Agregar 100μl de los gases de BCG lux a cada tubo de sangre, y para el control de un crecimiento del 2los tubos.
6. Mezclar bien y colocar el 3 bijous para el 96 h de duración punto y el 2, controla el crecimiento de su lado en la incubadora oscilante a 37 ° C, 20 rev / min (CO ₂ no es obligatorio).

5. Luminiscencia de medición (a 0hr y 96 horas)

1. Centrifugar los 3 bijous a 2000 g durante 10 minutos.
2. Retire con cuidado 300μl de sobrenadante sin perturbar el precipitado y el lugar de 2 ml con tapa de rosca microtubos para congelar a -80 ° C para el análisis posterior de citocinas.
3. Agregar 300μl de PBS a cada uno de bijou para reemplazar el volumen de sobrenadante retirado.
4. Aspirar el contenido de cada joya en el correspondiente tubo Falcon de 50ml y añadir 8 ml de agua destilada a cada tubo. Iniciar un temporizador de 10 minutos.
   Nota: Este es un paso sensible al tiempo, y la incubación no debe haber más de 10 minutos, a partir de cuando las primeras células entran en contacto con el agua.
5. Enjuague cada bijou con 2 ml de agua destilada y agitar durante 5 segundos antes de inflexión en el correspondiente tubo Falcon.
6. Al final de la incubación de 10 minutos, centrifugar los tubos falcon en 2000 g durante 10 minutos.
7. Decantar el sobrenadante en Surfanios desinfectante.
8. Añadir algunas perlas de vidrio para cada pastilla y agitar.
9. Añadir 1 ml de PBS estéril a cada tubo y agitar.
10. En los tubos de luminómetro, hacer diluciones 1:10 de cada muestra por duplicado con PBS (900μl PBS + 100μl de la muestra) y 96 h en el momento de punto. Hacer las mismas diluciones de cada uno de los controles de crecimiento.
11. Suavemente en el Vórtex y la carga en el luminómetro y tomar las lecturas (como se describió anteriormente)
    Nota: Las lecturas entre triplicado de la misma muestra deben estar dentro del 15% de uno a otro.

6. Los resultados representativos:

Es importante la utilización de bacterias en fase logarítmica de crecimiento para toda la sangre de los ensayos de lux, es decir, creció más de 48-72 horas antes de la inoculación de las muestras, como la actividad metabólica no es óptima, si bien en línea recta de la nevera o en fase estacionaria. El crecimiento antes debe estandarizarse para una serie de experimentos a 48 o 72 horas para evitar la variabilidad. La figura 1 muestra la curva de crecimiento de una cultura de representante de BCG lux. El tiempo de duplicación es de aproximadamente 24 horas hasta que se alcanza la fase estacionaria.

Figura 1. Representante de la curva de crecimiento de BCG lux durante 96 horas en medio 7H9 y la correlación de RLU y UFC.

Aunque los valores de RLU siempre se correlaciona con la UFC, el número de RLU que corresponde a una sola UFC puede variar dependiendo de las acciones, por lo que es una buena práctica para utilizar el stock congelado misma a través de una serie de experimentos para garantizar una multiplicidad de infección constante ( MOI).

La Tabla 1 muestra un ejemplo de la fecha de primas en el momento de la inoculación (T ₀₎ y en 96 horas. Los ratios de crecimiento se calculan utilizando la fórmula T ₉₆ / T _0, pero los intervalos de tiempo de otros, por supuesto, también puede ser medido. Es, sin embargo, no se recomienda el uso de las culturas más allá de 96 horas, como la muerte celular significativa.

Tabla 1. Ejemplo de los datos en bruto en el momento de la inoculación (T0) y en 96 horas (T96) y se calcularon los cocientes de crecimiento de 3 donantes adultos.

Dependiendo de las respuestas antígeno-específicas de la memoria disponible y el recuento de neutrófilos, posiblemente, también, las tasas de crecimiento varían entre los individuos, como se muestra en la Figura 2 en la sangre de los niños con y sin infección por el VIH. En promedio, los niños pequeños tienen mayores tasas de crecimiento que los adultos, prueba de la tuberculina (TST) + personas han tienen menores tasas de crecimiento que las personas han TST-, y los pacientes con VIH tienen altas tasas de crecimiento debido a la deficiencia de la población de células T CD4, uno de los principales mediadores de la respuesta inmune celular a la micobacteria.

Figura 2 variabilidad entre los donantes:. Ratios de crecimiento de T ₀ frente a 96 horas por un grupo de pacientes, dependiendo de la situación subyacente de VIH.

Reproducibilidad de los ratios de crecimiento durante un período de tiempo se muestra en la figura 3, que resume los resultados de 64 donantes sangrado dos veces en un período de 12 meses y de un solo donante sangrado varias veces para los experimentos de control. Entre las posibles causas de la variabilidad podría haber cambios en la sensibilidad de micobacterias o la variabilidad en los niveles de citocinas de acogida, como se observa en muchos bioensayos.

Figura 3. (A) solo donante en 12 ocasiones en 12 meses. (B) varios (64) donantes en 2 ocasiones más de 12 meses.

Discusión

Ensayos bactericidas en el contexto de la investigación vacunas contra la tuberculosis están bien establecidos en modelos animales, donde se aplican a la pantalla de vacunas potencialmente prometedores. La reducción de la carga bacteriana en las funciones de varios órganos como la principal lectura de la inmunogenicidad.

La primera generación de humanos ensayos bactericidas fueron diseñados utilizando los macrófagos solo, infectadas con el M. tuberculosis. UFC sirvió como la princip...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo	Empresa	No gato
BCG lux	Varios	n / a
Middlebrook 7H11 agar	Becton Dickinson	283810
Caldo de Middlebrook 7H9	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC enriquecimiento	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC suplemento	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma Aldrich	274364
Glicerol	Sigma Aldrich	G5150
Higromicina B	Roche	10843555001 (20 ml)
N-decil aldehído	Sigma	D7384-100G
Etanol (> 99,7%)	VWR	101077
PBS estéril	En Casa	n / a
RPMI-1640 con L-Glutamina, HEPES 25 mM	Sigma	R0883
El agua destilada estéril	En Casa	n / a
Equipo
Tubo luminómetro (puerto inyectable obligatorio)	Berthold AutoLumat LB953 o de un solo tubo de Sirius luminómetro
Tubos luminómetro, 12 x 75 mm, pyrex sin montura	Corning de VWR	99445-12
Erlenmeyer con tapones ventilados, estéril 250 ml de policarbonato	Corning a través de Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer tubos de extracción de sangre (heparina sin conservantes)	BD	367676
50 ml Falcon tubos cónicos	BD	352077
7ml Sterilin muestra de polipropileno bijou tubos	VWR	99445-12
Sterilin Universal de los contenedores (30 ml)	Laboratorio de Análisis LTD	128C
Cuentas de vidrio de 2 mm de diámetro	SigmaAldrich	Z143928
10 ml pipetas y pipetas niño	cualquier
1000μl y 200μl pipetas y puntas con filtro	cualquier
Equipo de laboratorio:
Clase II gabinete de seguridad del gabinete
Refrigerador (4 ° C)
Centrífugo
Mecedora agitador de plataforma (180 0) para mezclar los tubos
Agitador incubadora a 37 ° C para crecer cultivos bacterianos