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Artículo de método

Una introducción a las avispas parasitarias de

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DOI:

10.3791/3347

⸱

7 de mayo de 2012

 ,  ,  , 
1Biology Department, The City College of New York, CUNY, 2The Graduate Center, The City University of New York

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Parasitoide (parásitos) avispas constituyen una clase importante de enemigos naturales de muchos insectos, incluyendo Drosophila melanogaster. Vamos a introducir las técnicas para propagar estos parásitos en Drosophila Spp. y demostrar la forma de analizar sus efectos sobre los tejidos inmunes de Drosophila Larvas.

Resumen

La mayoría de las especies conocidas de avispas parasitoides atacan las etapas larvarias o de pupa de Drosophila. Mientras que Trichopria drosophilae infecta las etapas de pupa del huésped (Fig. 1A-C), las hembras del género Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) y Ganaspis (Fig. 1E) atacan las etapas larvarias. Utilizamos estos parásitos para estudiar la base molecular de una carrera armamentista biológica. Las avispas parasitoides tienen un valor inmenso como agentes de biocontrol. La mayoría de ellas portan factores de virulencia y otros que modifican la fisiología e inmunidad del huésped. El análisis de las avispas de Drosophila está proporcionando información sobre cómo las interacciones específicas entre especies moldean las estructuras genéticas de las comunidades naturales. Estos estudios también sirven como modelo para comprender la fisiología inmune de los huéspedes y cómo las reacciones inmunitarias coordinadas son frustradas por esta clase de parásitos.

La cutícula larvaria/pupal sirve como primera línea de defensa. El ovipositor de la avispa es una estructura afilada, semejante a una aguja, que introduce eficazmente los huevos en el hemocel del huésped. Tras la oviposición se produce una reacción de cicatrización en la cutícula (Fig. 1C, flechas). Algunas avispas pueden insertar dos o más huevos en un mismo huésped, aunque solo el desarrollo de un huevo tiene éxito. Los huevos supernumerarios o las larvas en desarrollo son eliminados mediante un proceso que aún no se comprende. Por ello, estas avispas se denominan parasitoides solitarios.

Dependiendo de la cepa de mosca y de la especie de avispa, el huevo de la avispa tiene uno de dos destinos. O bien es encapsulado, lo que impide su desarrollo (emerge el hospedador; Fig. 2 izquierda); o bien el huevo de la avispa eclosiona, se desarrolla, muda y crece hasta convertirse en adulto (emerge la avispa; Fig. 2 derecha). L. heterotoma es una de las especies mejor estudiadas de avispas parásitas de Drosophila. Es una "generalista", lo que significa que puede utilizar a la mayoría de las especies de Drosophila como hospedadores1. L. heterotoma y L. victoriae son especies hermanas y producen partículas similares a virus que interfieren activamente con la respuesta de encapsulación2. A diferencia de L. heterotoma, L. boulardi es un parásito especialista y el rango de especies de Drosophila que utiliza es relativamente limitado1. Las cepas de L. boulardi también producen partículas similares a virus3, aunque difieren significativamente en su capacidad para tener éxito en D. melanogaster1. Algunas de estas cepas de L. boulardi son difíciles de mantener en D. melanogaster1, ya que el hospedador frecuentemente logra encapsular sus huevos. Por lo tanto, es importante conocer a ambos socios en protocolos experimentales específicos.

Además de los tejidos de barrera (cutícula, intestino y tráquea), las larvas de Drosophila presentan respuestas inmunitarias sistémicas celulares e humorales que se originan a partir de las funciones de las células sanguíneas y del cuerpo graso, respectivamente. La oviposición por L. boulardi activa ambos componentes inmunitarios1,4. Las células sanguíneas se encuentran en circulación, en poblaciones sésiles bajo la cutícula segmentada y en el ganglio linfático. El ganglio linfático es un pequeño órgano hematopoyético ubicado en el lado dorsal de la larva. Grupos de células hematopoyéticas, denominados lóbulos, se disponen segmentariamente en pares a lo largo del vaso dorsal, que discurre según el eje anteroposterior del animal (Fig. 3A). El cuerpo graso es un órgano grande y multifuncional (Fig. 3B). Este secreta péptidos antimicrobianos en respuesta a infecciones microbianas y de metazoos.

La infección por avispas activa la señalización inmunitaria (Fig. 4)4. A nivel celular, desencadena la división y diferenciación de las células sanguíneas. Como mecanismo de defensa, se forman agregados y cápsulas en el hemocelo de los animales infectados (Fig. 5)5,6. Las células sanguíneas activadas migran hacia el huevo de avispa (o larva de avispa) y comienzan a formar una cápsula a su alrededor (Fig. 5A-F). Algunas células sanguíneas se agrupan para formar nódulos (Fig. 5G-H). Un análisis cuidadoso revela que la infección por avispas induce la dispersión de los lóbulos más anteriores de la glándula linfática en sus periferias (Fig. 6C, D).

Presentamos datos representativos con los componentes de la vía de transducción de señal Toll, Dorsal y Spätzle (Figs. 4,5,7), y su gen diana Drosomycin (Fig. 6), para ilustrar cómo se pueden estudiar cambios específicos en la glándula linfática y en el hemocelo tras la infección por avispas. Los protocolos de disección descritos aquí también permiten obtener los huevos de avispa (o estados en desarrollo de avispas) del hemolinfa del hospedador (Fig. 8).

Protocolo

El protocolo completo para el experimento se divide en cuatro etapas (Fig. 9). (1) El cultivo de las avispas en las larvas de mosca, (2) Configuración de las infecciones y la preparación de animales para la disección, (3) aislamiento y la fijación de huésped / parásito de las estructuras, (4) El análisis de los tejidos inmunes.

1. Avispas en el cultivo de larvas de Drosophila

Mantenimiento de las culturas de avispas requiere una planificación cuidadosa. Con relación a las moscas de cultivo, que es bastante laborioso. Mantenemos nuestras colonias de avispas en el laboratorio de larvas o pupas de la cepa yw de Drosophila a 24 ° C. El cultivo de las avispas se trata de mantener una fuente continua de los ejércitos en la etapa de derecho y la limpieza de los "infectados" viales de las moscas que surgen antes de que las avispas hacer. Las avispas siguen el método de determinación del sexo haplodiploid y por ello es importante que las hembras se aparean antes de que infecten a los anfitriones.

  1. El día 1, añadir un pequeño toque de recién pre-levadura comparación pasta (preparada mezclando 1 ml de agua en aproximadamente 1 g de levadura seca activa en un vial de mosca alimentos frescos La receta del alimento mosca no es crítica;. que crecen en el medio de moscas corn-meal/sucrose/agar. Lugar 50-60 joven (2-4 días de edad) para adultos yw (o otra cepa de tipo salvaje en esencia) vuela a poner huevos durante 48 horas a 24 ° C.
  2. El día 3, eliminar las moscas de los viales. Colocar un tapón de zumbido en el vial con una gota de miel en el lado interior del tapón zumbido. La miel se diluye 2:01 en agua destilada.
  3. Uso de CO 2, anestesiar a las avispas y ordenar 6-8 y 6-8 hembras los machos que son aproximadamente 2-3 días. Añadir a la ampolla que contiene 0-48 ejércitos antiguos hora. Tenga en cuenta que las avispas son más sensibles al CO 2 que las moscas, y puede que tenga que calibrar su exposición al gas. Investigadores de Drosophila no utiliza una anestesia estándar de Drosophila diseño de la estación. Un buen punto de partida para anestesiar a las avispas es establecer la presión de CO 2que aproximadamente la mitad de lo que se necesita para las moscas anestesiar.
  4. Vuelva a colocar el tapón de Buzz (con miel) en el vial. Con suavidad, coloque el frasco en su lado hasta que las avispas se despierta.
  5. Coloque estos viales con larvas de mosca y las avispas en una incubadora de 24 ° C.
  6. El éxito de las infecciones se retrasará pupariation ligeramente. Los hosts que han sufrido un ataque de avispa, pero son capaces de defenderse a sí mismos (o si no están infectados), continuar con el desarrollo siguiendo el horario normal y las moscas adultas emergen de estas pupas muy por delante de las avispas.
  7. Dependiendo de la especie de avispa y la temperatura, las avispas Eclose en 25-30 días.
  8. Quite las moscas adultas de los viales en los que las avispas se están desarrollando.

2. Configuración de las infecciones y preparación de animales infectados para Disección

Antes de empezar, tengo un par de vidrio limpio o platos de plástico Petri, un plato de Pyrex la disección con 9 depresiones, Kimwipes, agua destilada (en una botella con atomizador), El 70% de etanol (en una botella rociadora), 1X PBS (en una botella rociadora), portaobjetos, y una espátula pequeña, manejable limpio.

  1. Para configurar las infecciones, siga los pasos 1-5 arriba. Dependiendo del experimento, puede ser necesario el uso de máquinas que están aproximadamente a la misma fase de desarrollo. Para esto, egglays de 2-6 horas se puede utilizar para la infección.
  2. Para cosechar las larvas infectadas (para la disección de los tejidos inmunológicos o parásitos), retire el contenido de los viales de la mosca en un vaso pequeño de plástico o caja de Petri.
  3. El uso de un microscopio estereoscópico y unas pinzas finas (pinzas), cuidadosamente recogida 6-10 larvas, uno por uno y colocarlos en una depresión bien con PBS 1X primero, y luego transferirlos en el agua, el 70% de etanol, agua y PBS 1X, sucesivamente. El propósito de estos pasos es liberar a los animales de la mosca de alimentos y limpie bien y esterilizar su superficie. El enjuague en agua diluye el etanol y el enjuague final en PBS elimina el etanol. Para el Paso 3 a continuación, lo mejor es no salir de laanimales en PBS durante más de 10 minutos.

3. El aislamiento y la fijación de Host / parásito Estructuras

Fondo

El ganglio linfático larval es un pequeño órgano hematopoyético 7. En la tercera estadio larval, la glándula linfa contiene un gran par de lóbulos anterior que flanquean el vaso dorsal (Fig. 3A, 6B-C, 7A-D). Los lóbulos anteriores se dividen en regiones especializadas con propiedades de células únicas 7. Progenitores de tres tipos de células, plasmatocitos, lamellocytes y células de cristal residen en los lóbulos anterior. Células pericárdicos separar los lóbulos anterior de los lóbulos más pequeños posteriores. El ganglio linfático de Drosophila es un modelo para la hematopoyesis de insectos y mamíferos 8,9.

La grasa corporal es funcionalmente similar a la del hígado de mamíferos. La respuesta humoral se desencadena en el cuerpo de microbios siguiente de grasa o una infección de avispa 1,4,10. ComoEn consecuencia, una combinación única de genes de péptidos antimicrobianos son activadas y los péptidos son secretados en la hemolinfa 1. La grasa corporal es también el tejido primario para la producción de glucógeno y triglicéridos y almacenamiento 11. El cuerpo de las larvas de grasa ocupa el volumen sustancial de la hemocele y, por lo que a diferencia de la glándula linfática, es fácil de localizar. Ahora vamos a demostrar cómo disecar el ganglio linfático y la grasa corporal de larvas de tercer estadio.

Antes de empezar

¿Necesitas unas pinzas finas (pinzas) y de etanol limpiar portaobjetos.

Linfático disección de la glándula de larvas

  1. Con unas pinzas finas, seleccione una larva de tercer estadio mantuvo vagando en 1X PBS.
  2. Coloque la larva en un portaobjetos de microscopio.
  3. El uso de pinzas, la posición del animal con la cara ventral hacia arriba.
  4. El uso de dos pares de pinzas, mantenga el animal a cada lado del extremo posterior (puntas de flecha 1, Fig. 3A) y gently tirar de la cutícula para introducir un pequeño desgarro, superficial en la cutícula.
  5. La hemolinfa contiene hemocitos, el intestino y la grasa corporal comenzará a escapar de la cavidad del cuerpo. La hemolinfa se puede tomar con un 10 l "pipetteman" para hacer frotis, si es necesario.
  6. Colocando ambas pinzas en el lado derecho del animal debajo de los ganchos boca (puntas de flecha 2, fig. 3A), suavemente rasgar la cutícula.
  7. Mueva ambas pinzas hacia el lado izquierdo del animal debajo de los ganchos boca (puntas de flecha 2, fig. 3A) y cuidadosamente hacer otro pequeño desgarro.
  8. Mientras mantiene la boca ganchos del animal, tire suavemente la cutícula hacia el extremo posterior del animal (como si pelar de nuevo).
  9. A medida que la cutícula se retiró, el cerebro, la grasa corporal, los discos imaginales, las glándulas salivales, y se convertirá en proventrículo expuestos. La cutícula es ahora independiente en el extremo posterior, pero aún tendrá el vaso dorsal con el ganglio linfático que se le atribuye.
  10. Cortar el proventrículo y alejarlo de la zona de la glándula linfática. El ganglio linfático será debajo del cerebro, aunque puede que no sea capaz de verlo.
  11. Con cuidado, se burlan de distancia de la grasa corporal, el intestino, las glándulas salivales y otras estructuras que pueden estar sentados en la glándula. Tenga cuidado de no separar el ganglio linfático de la glándula anillo y el vaso dorsal situado por detrás del cerebro. El ganglio linfático se colocará plana contra el portaobjetos del microscopio.
  12. Retire con cuidado todos los tejidos adicionales fuera de la glándula linfática hasta que toda la glándula se desarrolla en los lóbulos anteriores de la serie final de las células del pericardio.

Nota: Un ganglio linfático disección adecuada tendrá un par de lóbulos anterior y dos pares de lóbulos posteriores a lo largo del vaso dorsal (Fig. 6B). Los lóbulos se pueden dañar fácilmente o se pueden caer desde el vaso dorsal. Las muestras por lo tanto, debe manejarse con mucho cuidado. La glándula también hcomo una tendencia a arrugarse o contrato. Suavemente enderezar el órgano en su extremo posterior, permite que todas las partes y las células que se presentará también. Esto es especialmente necesario para los protocolos de inmunotinción.

Fay la disección del cuerpo

  1. En el escenario de la disección Zeiss 1000 microscopio de disección (cualquier equipo estéreo microscopio de disección se puede utilizar), coloque un cuadro de luz que permite que la luz incidente se transmite a través de la muestra. Coloque tercera larva de la Etapa 2 en un portaobjetos en 200 l de PBS 1X. Incline la fuente de luz fuera de la muestra, de modo que el organismo aparece transparente y por lo tanto es fácil de visualizar sus órganos internos.
  2. El uso de pinzas, la posición del animal para que el extremo anterior está lejos de ti.
  3. El uso de pinzas, mantenga la cutícula de la larva en el lado izquierdo de anzuelos de la boca (punta de flecha 1, fig. 3B). Utilizando las pinzas otros, suavemente rasgar la cutícula todo el camino hasta el extremo posterior (arrowhead 2, Fig. 3B). No rasgar la cutícula lejos del cuerpo en el extremo posterior.
  4. Muy suavemente empezar a eliminar el intestino a un lado.
  5. Suavemente retirar el cerebro, los discos imaginales, y la glándula anillo con el ganglio linfático ejecuta a través del vaso dorsal.
  6. No quite las glándulas salivales ya que es el cuerpo de grasa adherida a estas glándulas.
  7. Retire con cuidado la cutícula y dejar la grasa corporal en la diapositiva en 1X PBS.

Nota 1: La grasa corporal tiene sólo una capa de células y por tanto es importante tener todas las células aplanadas en el mismo plano en el portaobjetos de vidrio. Las células son endopolyploid y fácil de visualizar. Una muestra de cuerpo bien diseccionado grasa debe mantener contactos normales de las células, y deben tener un mínimo de glóbulos de grasa alrededor de la muestra de disección (Fig. 6i, J).

Nota 2: Si los huevos de avispa no se verán afectados por el sistema inmune del huésped, se iniciate el desarrollo casi de inmediato. Los primeros estadios de desarrollo del parásito (de la larva huésped) son fácilmente accesibles desde el hemocele disección (Fig. 8). Huevos de parásitos o larvas o bien se adhieren a la grasa corporal o de otros órganos, o simplemente se deslizan sobre el portaobjetos de vidrio durante la disección.

4. El análisis de tejidos inmunes

  1. Aire ganglios linfáticos secos durante 5-10 minutos y quitar 1X PBS a partir de la diapositiva de grasa corporal antes de fijar durante 5-10 minutos con paraformaldehido 4% preparada en PBS. Cada diapositiva puede tener varios ganglios linfáticos disecados para la tinción. Mover diapositivas con las muestras fijadas en una cámara humidificada casera para los pasos subsiguientes. Esta cámara se prepara mediante la colocación de dos piezas de toallas de papel húmedas plegadas, en la parte inferior de una caja de punta de plástico vacío micropipeta. Uno o más diapositivas con muestras pueden ser colocados en la parte superior del divisor utilizado para sujetar las puntas.
  2. Como tal, el análisis de los tejidos inmunes se realiza siguiendo métodos estándar quese combinan en el etiquetado de células in vivo y 4 inmunohistoquímica indirecta.

5. Los resultados representativos

  1. Infección por Avispa activa la expresión del reportero vía de peaje Drosomycin-GFP (Fig. 6 G, J). En este experimento, el efecto de avispa-infestación sobre la expresión génica es visualizado en vivo utilizando un GFP-reportero unido al promotor Dres 12. En los animales de control no infectadas, la expresión GFP no se detecta. La señal de GFP se detecta claramente en el citoplasma y el núcleo de las células de la grasa corporal, disecados de animales infectados con L. victoriae. Para obtener los mejores resultados, la relación de las avispas: las máquinas debería ser 1:10. La infección debe durar durante al menos 2 horas. Infestación de Correos, se intensifica la señal de los doctores-GFP y muchas células de grasa corporal son las buenas prácticas agrarias-positivas, incluso hasta 72 horas 1,4.
  2. Infección por Avispa induce la diferenciación de lamellocytes en la lglándula ymph (Fig. 6D). Lamellocytes rodear y bloquear el desarrollo de avispa (Fig. 6H). Los ganglios linfáticos son disecados para visualizar los cambios celulares inducidos en los lóbulos anteriores después de L. victoriae infección. Recientemente disociados lamellocytes están presentes en la periferia de los lóbulos disecados; lamellocytes están marcados con un transgén GFP que es impulsado por el deforme potenciador (MSNF9-GFP). Todas las células se visualizan con actina filamentosa utilizando rodamina marcado con faloidina. Nótese que la integridad de los lóbulos anterior se interrumpe en estas glándulas como la membrana basal que rodea normalmente el lóbulo de forma continua (Fig. 6C), es ahora discontinua (Fig. 6D). Desde las disecciones mismos, lamellocytes en la hemolinfa también puede ser visualizado en frotis (Fig. 6G); algunos de los cuales están asociados con la estructura cápsula formada para bloquear el desarrollo del parásito (Fig. 6H).
  3. Sproteína pätzle se expresa en la mayoría de las células del ganglio linfático de larvas (fig. 7C, D). Para detectar SPz en los ganglios linfáticos disecados, hemos seguido un protocolo estándar para la tinción de las células del ganglio linfático con anticuerpos anti-SPZ anticuerpos 4. In vivo, SPz aumento de los niveles en las células de las glándulas linfáticas después de la infección de avispa (compárese con los paneles de la figura. E 7C, con 7G, I, y 7D paneles, F con 7H, J).
  4. Las etapas tempranas y tardías de desarrollo de las larvas de la avispa de acogida y pupas (Fig. 8). Para examinar las etapas de desarrollo de las avispas, larvas infectadas se diseccionan en diversos puntos temporales después de la oviposición. Aquí mostramos un ejemplo de estas etapas de la Leptopilina spp. De tipo salvaje infectado D. melanogaster instalados.

Figura 1
Figura 1. Las diferentes especies de avispas y de oviposición de huevos de avispa. Todas las imágenes se obtuvieron usando un microscopio estereoscópico Leica. Una avispa hembra oviposita Trichopria drosófilas huevo en un D. melanogaster pupa. Ampliación B de la postura de la mosca de la fruta en anfitriones Trichopria pupa. puntos C melanina indican curación de heridas en el sitio de oviposición. D L. boulardi masculino. E G. xanthopoda hembra. F L. mujer victoriae. G L. heterotoma masculino (izquierda) y el femenino.

Figura 2
Figura 2. Los ciclos de vida que muestran la carrera de marcha / avispa brazos. Los resultados de la oviposición en uno de dos resultados. Cualquiera de las reacciones inmunitarias del huésped éxito para bloquear el desarrollo de la avispa (izquierda), o la avispa frustra Respo inmune del huéspedNSES y tiene éxito (derecha). Modificado de Melk y Govind, 1999 18.

Figura 3
Figura 3. Larvas de tercer estadio mostrando los órganos de interés antes de la disección. Todas las imágenes se obtuvieron usando un microscopio estereoscópico Leica. Un hml> larva de buenas prácticas agrarias con las buenas prácticas agrarias (verde) de fluorescencia (flecha) en las células individuales de la glándula linfática indica la ubicación general de las glándulas linfáticas en un animal intacto. La larva fue fotografiada con la óptica de campo de fluorescencia y brillante. Puntas de flecha apuntan a los lugares importantes para el protocolo de Disección de ganglios linfáticos se describe en el texto. B Cg> larva de buenas prácticas agrarias con la expresión de GFP en la grasa corporal para indicar la ubicación del órgano en un anim intactacol. Puntas de flecha apuntan a los lugares importantes para el protocolo de disección de la grasa corporal descrita en el texto.

Figura 4
Figura 4. Inmuno-genética circuito de la respuesta inmune del huésped contra los componentes básicos de parasitoides ataque. De la vía de peaje se muestran. Spätzle (SPZ) es activado por la enzima proteasa de procesamiento Spätzle, SPE. Activado SPz sirve como ligando de peaje. Señalización intracelular conduce a la activación de factores de transcripción NF-kB, dorsales y el DIF. Cactus sirve como inhibidor IkB de la vía. La activación de Drosomycin, una vía canónica Línea gen diana, se puede controlar el uso de cepas transgénicas de mosca con el reportero GFP (ver fig. 6I, J).

Figura 5
Figura 5. La encapsulación en respuesta a L. victoriae infestación enSerpiente> GFP-dl anfitriones de Drosophila. Un potenciador en el gen de la serpiente se expresa en células de la sangre 13. Cuando este potenciador impulsa la expresión de la proteína de fusión GFP-dorsal en un transgén, dorsal se detecta a través de la fluorescencia verde de GFP en algunos plasmatocitos y lamellocytes que componen las cápsulas y los agregados. Todas las imágenes fueron obtenidas con un microscopio confocal Zeiss LSM. Un huevo de L. aumentos victoriae. Lamellocytes BD (flechas blancas) en el extremo posterior de la autorización expresa de huevo GFP-Dorsal. CD más altos de la muestra en el panel B. EH Las muestras son contrastados con rodamina-phalloidin etiquetados para visualizar actina filamentosa (F-actina, rojo) y con Hoechst 33258 para visualizar el ADN (azul). E encapsulado huevo de L. victoriae. F melanized cápsula de L. victoriae. GH L. victoriae INFEcción induce a la célula de sangre (plasmatocyte y lamellocyte) la agregación.

Figura 6
Figura 6. La respuesta inmune contra la infección de avispa. Imágenes de los grupos A y B se obtuvieron utilizando un Zeiss Axio Scope. Las imágenes de los paneles de CJ se obtuvieron usando un microscopio confocal Zeiss LSM. Una larva que muestra huevos de avispa melanized encapsulado (punta de flecha) a través de la cutícula transparente. B Representante tercer estadio larval ganglio linfático se tiñeron con Hoechst 33258 revela células de todos los lóbulos y las células intercaladas del pericardio. Barra de escala representa 100 μ. CJ Todas las muestras se tiñeron con Hoechst 33258 (a los núcleos de la etiqueta) y rodamina phalloidin (para marcar la F-actina). CD Anterior lóbulos de las glándulas linfáticas del control (C) y L. victoriae-infectados (D) MSNF9-GFP animales. En los animales infectados, la expresión ESNG potenciador, específicos para lamellocytes 14, se detecta con un reportero GFP nuclear. plasmatocitos E aisladas de animales infectados no expresan las buenas prácticas agrarias. Estos animales tienen muy pocas o ninguna. Lamellocytes F plasmatocitos (GFP-negativo, flecha corta) y recién diferenciados, lamellocytes más grandes (flechas largas) con expresión débil GFP nuclear de L. victoriae infectada MSNF9-GFP larvas. G libres y agregados plasmatocitos y lamellocytes del hemocele de una L. victoriae infectada Dres-GFP larvas. La expresión del reportero de los doctores-GFP se activa en algunos plasmatocitos (flecha corta), pero no en lamellocytes (flechas largas) después de la infección. H encapsulado y larva de avispa melanized de L. boulardi infectados MSNF9-GFP larva huésped. Numerosos MSNF9-GFP-positivas lamelloctyes rodean a la larva de avispa (estructura oscura; flecha gruesa) y muestran una fuerte expresión GFP nuclear (flechas largas). Esta bandejaEl previamente publicado en PLoS One 15. IJ células de grasa corporal disecados de infectados (I) y L. victoriae-infectado (J) Dres-GFP larvas. GFP es nuclear y citoplasmática en las células de grasa corporal de los animales infectados. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 7
Figura 7. Spätzle expresión después de la infección avispa parasitoide. Las muestras AJ se counterstained con Hoechst 33258 para visualizar el ADN. Todas las imágenes fueron obtenidas con un microscopio confocal Zeiss LSM. Lóbulos AF Anterior disecados a partir de larvas yw no infectada. Las muestras fueron procesadas por inmunotinción indirecta sin anticuerpo primario (A y B) o con anticuerpos anti-spz anticuerpo (rojo; C, D, E, F) y counterstained con Alexa Harina-faloidina a etiqueta F-actina en las células (verde;. B, D, F) GJ Anterior lóbulos disecados a partir de larvas yw infectada y teñidas con anti-anticuerpos SPz (rojo, G, H, I, J) y Alexa Fluor-phalloidin (verde. Paneles H, J) EF mayores aumentos de muestras en C y D, respectivamente. aumentos IJ superior de las muestras en G y H, respectivamente. Las barras de escala en los grupos ad, G, H representan 50 micras.

Figura 8
Figura 8. Fases de larva y pupa de L. heterotoma y L. boulardi. etapas individuales se aislaron de infestación de la mosca después de larvas y adultos los ejércitos, como se indica. Todas las imágenes se obtuvieron utilizando un Zeiss Axio Scope. Fila superior AF L. etapas heterotoma, 1-6 días después de la infección. fila inferior AF postembrionario L. boulardi etapas, de 4 a 12 días después de la infección.

figure-protocol-9 Figura 9. Diagrama de flujo del protocolo experimental.

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Discusión

El interés por las avispas parásitas de Drosophila está surgiendo como las técnicas moleculares para descifrar genomas completos se vuelven eficientes y rentables. Sin embargo, en relación con sus excepcionalmente bien estudiados los ejércitos, muchos aspectos fascinantes de la biología avispas siguen siendo oscuros. Estos incluyen temas relacionados con la gama de huéspedes, la inmunosupresión, superparasitismo, y el comportamiento. El objetivo de esta presentación fue demostrar los efectos de la infección en ...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos con el profesor Todd Schlenke Trichopria de mosca de la fruta, el profesor Tony Ip cepas de moscas transgénicas, y el Prof. Carl Hashimoto para el anti-Spätzle anticuerpos. Damos las gracias a los miembros actuales y anteriores del laboratorio por sus contribuciones a esta presentación. Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: a partir de los NIH (S06 GM08168, RISE 41399-009, y G12 RR03060-), el USDA (NRI / USDA CSREES 2006-03817 y 2009-35302-05277) y PSC-CUNY.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materiales Tipo Empresa Número de catálogo
Materiales para el mantenimiento de los cultivos de insectos
Levadura Seca activa Fisher Scientific S802453
Fly alimentos La harina de maíz, el azúcar Receta estándar
Miel Trébol Oro holandesa
Viales Polipropileno shell viales (estrecho) Fisher Scientific AS514
Cierres de los viales Algodón enchufe Fisher Scientific AS212
Cierres de los viales Zumbido enchufe Genesee Científico AS273
Estufa refrigerada Precision 815 Thermo Scientific 3721
Los materiales para la preparación de muestras
Cilindro de CO 2 Grado de sequedad del hueso TW Smith UN1013
Espátula Espátula de micro (14 cm) Fisher Scientific 21-401-15
Pyrex placas planas de prueba 9-así placa de la disección de 85 mm x 100 mm Thomas Scientific 7812G17
Pipetas Pasteur La cal sodada J & H Berge 71-5200-05
Fórceps Estilo # 5 Sigma T-4662
Etanol 190 prueba de la USP Fisher Scientific 04-355-221
Formaldehído 37% w / w Fisher Scientific F79-1
Anticuerpo secundario Cy3 AffiniPure burro anti-conejo IgG (H + L) 1:50 excitación de 546 nm; de emisión 565 nm Jackson Immuno Research Laboratories, Inc. 711-165-152
Antifade (N-propil galato) 4 mg / ml en glicerol al 50% en 1X PBS MP Biomedicals 10274790
Glicerol Fisher Scientific G-33-1
Hoechst 33258 0,2 g / ml de excitación 352 nm, emisión 461 nm Molecular Probes H-1398
Rodamina phalloidin 200 unidades / ml (6,6Excitación mM) 540 nm; de emisión 565 nm Molecular Probes R415
Alexa Fluor 488 phalloidin 300 unidades / ml de excitación de 495 nm, emisión 518 nm Molecular Probes A12379
Desechables
Botella de lavado Fisherbrand Fisher Scientific 03 a 409-22A
Kimwipes Kimberly Clark Fisher Scientific 06-666A
Toallas de papel 1 capa C-Fold Pluma 901-7CFTB2400
Microscopía Ynbsp;
Leica estereomicroscopio MZFLIII Imperio Imaging Systems, Inc. 10446208
Zeiss Estereomicroscopio Stemi 1000 o 2000, C- Carl Zeiss 000000-1006-126
Fuente de Luz - LED Cuello de cisne iluminador Fisher Scientific 12563501
Etapa Caja de luz transmitida con placa Carl Zeiss 455137000
Zeiss microscopio confocal de barrido láser LSM 510 Carl Zeiss
Microscopio compuesto Zeiss Axioplan 2 en posición vertical Carl Zeiss
Las cepas de avispa Fly Cueles
Leptopilina victoriae 16 yw
Leptopilina boulardi 17 1 UAS-GFP-Dorsal 17
Leptopilina heterotoma 2 SerpentHemoGal4 13
Leptopilina heterotoma 14 1 MSNF9 moCherry-14
Trichopria drosófilas Sólidos lácteos no grasos 15-GFP
Ganaspis xanthopoda 18 YW-Serpiente Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc 4
PA; Drosomycin-GFP/CyO y + 12

Referencias

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