Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

Resumen

A la inversa sistema de genética de la cepa del virus de la fiebre del Valle del Rift MP-12 vacuna es una herramienta útil para la creación de nuevas MP-12 mutantes con mayor atenuación e inmunogenicidad. Se describe el protocolo para la generación y caracterización de cepas mutantes Sociedades Nacionales.

Resumen

Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV), que causa la fiebre hemorrágica, trastornos neurológicos o ceguera en los seres humanos, y una alta tasa de aborto y de malformaciones fetales en los rumiantes ^1, ha sido clasificado como HHS / USDA se superponen agente de seleccionar un agente patógeno y el nivel 3. Pertenece al género Phlebovirus de la familia Bunyaviridae, y es uno de los miembros más virulenta de esta familia. Varios sistemas de genética inversa para la cepa RVFV MP-12 ^2,3 vacuna, así como las cepas salvajes RVFV ^4-6, incluyendo ZH548 y ZH501, se han desarrollado desde el año 2006. El MP-12 cepa (que es un grupo de riesgo 2 y un agente patógeno no seleccionar) está muy atenuado por varias mutaciones en su M y L-segmentos, pero todavía lleva virulenta S-segmento de ARN ^3, que codifica una virulencia funcional factor, NSS. El rMP12-C13type (C13type) la realización de 69% en el marco de la eliminación de Sociedades Nacionales ORF carece de todas las funciones conocidas Sociedades Nacionales, al mismo tiempo que se replica como eficient al igual que el MP-12 en células que carecen de VeroE6 tipo I IFN. Sociedades Nacionales induce una desconexión de la transcripción de host, entre ellos el interferón (IFN) beta-ARNm ^7,8 y promueve la degradación de la doble hélice de proteína quinasa dependiente de ARN (PKR) en el nivel post-traduccional ^9,10. IFN-beta es transcripcionalmente regulado al alza por el interferón factor regulador 3 (IRF-3), NF-kB y la proteína activadora-1 (AP-1), y la unión de IFN-beta de IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) estimula la transcripción de IFN-alfa genes u otros genes de interferón estimulado (ISGs) ^11, lo que induce a las actividades de acogida antiviral, mientras que la supresión de acogida transcripción incluyendo IFN-beta de genes por Sociedades Nacionales evita que el gen de los upregulations ISGs en respuesta a la replicación viral a pesar de la FIC-3, NF-kB y activador proteína-1 (AP-1) puede ser activada por RVFV7. . Por lo tanto, NSS es un excelente objetivo para atenuar aún más MP-12, y para mejorar las respuestas inmunitarias del huésped natural por la abolición de la función de supresión de IFN-beta. Aquí, Se describe un protocolo para la generación de una proteína recombinante MP-12 Sociedades Nacionales de codificación mutado, y proporcionar un ejemplo de un método de cribado para identificar mutantes que carecen de Sociedades Nacionales de la función de reprimir IFN-beta síntesis de ARNm. Además de su papel esencial en la inmunidad innata, el tipo de IFN-I es importante para la maduración de las células dendríticas y la inducción de una respuesta adaptativa inmune ^12-14. Por lo tanto, la inducción de mutantes Sociedades Nacionales de tipo I IFN son más atenuados, pero al mismo tiempo son más eficientes para estimular respuestas inmunes del huésped de tipo salvaje MP-12, que los convierte en candidatos ideales para los enfoques de vacunación.

Protocolo

1. Recuperación de MP-12 recombinante mutación Sociedades Nacionales de codificación (s) a partir del plásmido ADN ²

1. Propagación de riñón de hámster bebé (BHK) / T7-9 celdas ^15, que expresan establemente T7 ARN polimerasa, en 6 cm de platos en medio mínimo esencial (MEM)-alfa (Invitrogen, Cat. # 32561037) con 10% de suero fetal bovino (FBS ), penicilina-estreptomicina (penicilina: 100 U / ml, estreptomicina: 100 ug / ml) (Invitrogen, Cat. # 15140122), y 600 mg / ml de higromicina B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
   * La eficiencia de la recuperación viral es mayor en los platos de 6 cm que en los platos de 35 mm. BHK/T7-9 células con e....

Discusión

Invertir los sistemas de la genética para RVFV han sido desarrollados por varios grupos mediante la utilización de promotor T7 ^2,4,5 o ratón de ³ o ⁴ humanos promotor de Pol-i. En este artículo, se describe un protocolo para generar recombinantes RVFV MP-12 cepas mediante el uso de células BHK/T7-9 ¹⁵ que expresan establemente T7 ARN polimerasa. La eficiencia de la recuperación viral variado dependiendo de la condición de BHK/T7-9 las células, la cantidad de plásmidos, el núme.......

Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Medio esencial mínimo (MEM)-alfa	Invitrogen	32561037
Medio esencial modificado de Dulbecco mínimo	Invitrogen	11965092
Modificado Medio Eagle (MEM 2x)	Invitrogen	11935046
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140122
Higromicina B	Cellgro	30 a 240-CR
Triptosa fosfato de caldo	MP Biomedicals	1682149
Agar Noble	VWR	101170-362
Transit-LT1	Mirus	MIR2300
Opti-MEM	Invitrogen	31985070
Tapa hermética de aerosol	Eppendorf	C-2223-25
0,33% de solución de rojo neutro	Sigma Aldrich	N2889-100ML
C57/WT MEF células	Invivogen	MEF-c57wt
Blasticidin S	Invivogen	Ant-V-1
Zeocin	Invivogen	ant-Zn-1
Quanti-Blue	Invivogen	rep-QB1
BHK/T7-9 células 15	Universidad de Gifu, Japón
Células Vero E6	ATCC	CRL-1586