Propagación y detección de un clon infeccioso molecular de Maedi-Visna virus que expresa la proteína fluorescente verde

Resumen

Se describe un clon molecular del virus Maedi-visna que expresa GFP y es totalmente contagioso. La replicación de este virus puede ser detectado mediante el uso de microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.

Resumen

Maedi-visna virus (MVV) es un lentivirus de ovejas, causando neumonía intersticial lentamente progresiva y encefalitis ^1. Las células diana principal de MVV in vivo son considerados como una de las ² linaje monocitos. Ciertas cepas de MVV puede replicar en otros tipos celulares, sin embargo, ^3,4. La proteína verde fluorescente es un indicador comúnmente utilizado para el estudio de los lentivirus en las células vivas. Hemos insertado el gen EGFP en el gen de la dUTPase de MVV. El gen dUTPase está bien conservada en la mayoría de las cepas de lentivirus de ovejas y cabras y se ha demostrado que es importante en la replicación de CAEV ^5. Sin embargo, dUTPase ha demostrado ser prescindible para la replicación del clon molecular de MVV utilizado en este estudio, tanto in vitro como in vivo ^6. Replicación de MVV se limita estrictamente a las células de oveja o de cabra de origen. Nosotros usamos una línea celular primaria del plexo coroideo de oveja (células SCP) para la transfección y la propagación del virus de la ^7. La MVV fluorescente es totalmente infecciosa y la expresión EGFP es estable durante al menos seis pasajes ^8. Existe una buena correlación entre las mediciones de DICT ₅₀ y EGFP. Este virus por lo tanto, debe ser útil para la detección rápida de las células infectadas en los estudios de patogenicidad y tropismo celular in vitro e in vivo ^8.

Protocolo

1. Transfección

El clon molecular está contenida en dos plásmidos, p8XSp5-EGFP y p67r, de 12 kb y 4,5 kb, respectivamente, ^9,10.

1. Corte cantidades equimolares de los dos plásmidos, es decir, 4,4 g de p8XSp5-EGFP y 1,6 g de p67r con XbaI y ligar antes de la transfección.
2. Para la ligadura, utilice una unidad de Weiss de la ligasa en una reacción de 50 l, y se incuba a 16 ° C durante la noche.
3. Cuando la ligadura se haya completado, se incuba la mezcla de ligación a 65 ° C durante 15 minutos para la inactivación de la ligasa. Este paso puede ser omitido.
4. Dos días antes de la transfección, las....

Discusión

La GFP expresar clon molecular de MVV que aquí se presenta debe ser útil para el análisis de las interacciones de la célula huésped y la patogenicidad de MVV tanto in vitro como in vivo. El virus obtenido después de 7-14 días de la replicación, sin duda, ha adquirido algunas mutaciones debido a la inexactitud de la transcriptasa inversa. Sin embargo, hay limitaciones en el uso de este clon como un vector de ciclo único. Una de ellas es que el uso de la clonación se limita a las células de ovejas y cabras de origen. La e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
DMEM	Gibco	10938025
Opti-MEM	Gibco	51985018
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019