Este es un protocolo para aislar Kinesin activos de larga duración de la Drosophila Para los estudios de embriones de una sola molécula biofísicos. Mostramos cómo recoger los embriones, hacen que el lisado de embrión, y luego se polimerizan los microtúbulos (MTS). Kinesin se purifica mediante la inmovilización de que en el MT, girando hacia abajo los complejos MT Kinesin-, y luego soltar el kinesina de la MTs mediante la adición de ATP.
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Artículo de método
Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones
En este artículo
Resumen
Resumen
Proteínas motoras se mueven cargas a lo largo de los microtúbulos, y transportarlos a determinados lugares subcelulares. Dado que el transporte alteración se sugiere que la base de una variedad de enfermedades neurodegenerativas, la comprensión de los microtúbulos de transporte basada en el motor y su regulación es probable que en última instancia conducir a mejores estrategias terapéuticas. Kinesin-1 es una proteína motora eucariotas que se mueve en una dirección anterógrada (más extremo) a lo largo de los microtúbulos (MT), impulsado por la hidrólisis de ATP. Aquí se presenta un detallado protocolo de purificación para aislar kinesina activos de larga duración a partir de embriones de Drosophila, lo que permite la combinación de la genética de Drosophila con los estudios de una sola molécula biofísicos. A partir de aproximadamente 50 tazas de ponedoras, con aproximadamente 1.000 mujeres por cada taza, se llevó a cabo las colecciones de la noche. Esto proporcionó aproximadamente 10 ml de embriones envasados. Los embriones fueron dechorionated cloro (que produce aproximadamente 9 gramos de embriones), y se homogeneiza a continuación. After interrupción, el homogenado se aclaró mediante un giro de baja velocidad seguido por una centrifugación a alta velocidad. El sobrenadante clarificado se trató con GTP y el taxol para polimerizar MTs. Kinesin se inmovilizó sobre polimerizado MTs añadiendo el análogo de ATP, 5'-ciclasa imidodiphosphate a temperatura ambiente. Después de quinesina unión, los microtúbulos se sedimentaron mediante centrifugación a alta velocidad a través de un colchón de sacarosa. El sedimento de los microtúbulos se volvió a suspender, y este proceso se repitió. Por último, el ATP se añadió para liberar la kinesina de la MT. Centrifugación de alta velocidad luego centrifugadas la MT, dejando la quinesina en el sobrenadante. Este quinesina se sometió a una filtración centrífuga utilizando un corte 100 KD fuera filtro para una purificación adicional, alícuotas, se congelaron en nitrógeno líquido, y se almacenó a -80 ° C. Electroforesis en gel SDS y Western Blot se realizó utilizando la muestra purificada. La actividad motora de muestras purificadas antes y después de la etapa final de filtración centrífugase evaluó mediante un ensayo in vitro de una sola molécula de microtúbulos. Las fracciones kinesin antes y después de la filtración centrífuga mostró procesividad como ya se ha informado en la literatura. Otros experimentos están en marcha para evaluar la interacción entre kinesina y otras proteínas relacionadas con el transporte.
Protocolo
Las cepas de moscas se pueden comprar y se amplifica en el laboratorio. Dependiendo de la cantidad de frascos de cultivo de Drosophila recibidos, una necesidad de frecuencia 'voltear' los frascos de cultivo, una vez que los viales ha alcanzado su capacidad máxima. La ampliación continúa hasta alrededor de 50 frascos de cultivo de Drosophila se llenan. Entonces se hace "volar tazas" con vasos de 100 ml de tres picos (Fly toma la taza se discute en la siguiente sección). Después de 24 horas, uso de embriones a partir de estos vasos a los frascos de cultivo de semillas nuevas de Drosophila con la comida mosca pegada en la parte inferior. A tem....
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Discusión
Cerebro bovino es el material más utilizado para purificar a partir 11 de longitud completa quinesina, aunque el cerebro murino se ha utilizado como bien 12. Una gran desventaja del uso de cerebro bovino como fuente quinesina es la disponibilidad de material fresco de partida: mataderos son típicamente inaccesible, y el cerebro debe ser extremadamente fresco con el fin de obtener quinesina activo. Además, sólo los cerebros de vacas jóvenes son eficaces. Por último, la manipulación genética de las v.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Un agradecimiento especial a Kris Ngai y Jason Del Río por su apoyo y ayuda en este proyecto. Este trabajo fue apoyado por subvenciones RO1 GM070676 a SPG.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo o material | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Agar (granulada) | Pescador | 1423-500 | |
| Dextrosa (D-glucosa) anhidro | Pescador | D16-3 | |
| Placas de Petri | Becton | 35 1007 | Estilo de 60x15mm (Poliéster) 20/bag |
| Drosophila Cultura Viales | UCI | ||
| Tricornio vaso de precipitados | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volumen: 100 ml, Tamaño: 58x72mm |
| Levadura | Estrella Roja | 2751 | |
| Malla de nylon | Genesse Científico | 57-102 | 120 mIcron tamaño de poro |
| Malla de nylon | Piezas pequeñas | 06-350/35 | |
| Tubería | Sigma | 108321-27-3 | |
| Tubería | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glicerol | Pescador | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS0 4 (anhidro) | Pescador | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptina | Sigma | 103476-89-7 | |
| AprotOnin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| Infecciones de transmisión sexual | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analógica 5'-ciclasa imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra centrífugas Filtros: 0.5 ml, 100kD cortadas, paquete de 8 | Millipore | UFC510008 |
Referencias
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A.
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Reimpresiones y permisos
