Demostramos cómo diseccionar y la cultura de pollo ganglio statoacoustic E4 y E6 explantes de la médula espinal. Los explantes se cultivaron en condiciones libres de suero en geles de colágeno en 3D durante 24 horas. La capacidad de respuesta neuritas se prueba con el factor de crecimiento medio suplementado y con recubrimiento de proteínas cuentas.
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Artículo de método
La disección del ganglio y Cultura polluelo Statoacoustic y explantes médula espinal en geles de colágeno para ensayos neurite
En este artículo
Resumen
Resumen
Los órganos sensoriales del oído interno de pollo son inervados por los procesos periféricos del ganglio statoacoustic (SAG), las neuronas. Inervación sensorial del órgano depende de una combinación de señales de orientación axón 1 y 2 factores de supervivencia situadas a lo largo de la trayectoria de los axones en crecimiento y / o dentro de sus objetivos órgano sensorial. Por ejemplo, la interferencia funcional con una vía axón orientación clásica de señalización, semaforina-neuropilina, genera misrouting de los axones ótica 3. Además, varios factores de crecimiento expresados en los objetivos sensoriales del oído interno, incluyendo la neurotrofina-3 (NT-3) y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), han sido manipulados en animales transgénicos, lo cual también misrouting de 4 axones SAG. Estas mismas moléculas promueven la supervivencia y crecimiento de las neuritas de neuronas SAG pollo in vitro 5,6.
En este sentido, describir y demostrar el método in vitro que actualmente ucantar para poner a prueba la capacidad de respuesta de neuritas SAG de pollo a las proteínas solubles, como morfógenos conocido como el Wnts, así como los factores de crecimiento que son importantes para promover la extensión de neuritas SAG y la supervivencia de las neuronas. El uso de este sistema de modelo, que esperamos para sacar conclusiones sobre los efectos que los ligandos secretados pueden ejercer sobre la supervivencia de las neuronas SAG y crecimiento de las neuritas.
Explantes SAG se diseccionan en el día embrionario 4 (E4) y cultivadas en geles de colágeno tridimensional bajo condiciones libres de suero durante 24 horas. En primer lugar, la capacidad de respuesta de neuritas es probado por el cultivo de explantes con la proteína-medio suplementado. Luego, para preguntar si las fuentes puntuales de ligandos secretados pueden tener efectos direccionales en neurite, los explantes son co-cultivadas con granos recubiertos de proteínas y ensayados para la capacidad de la cuenta para promover a nivel local o inhibir la extensión. También se incluye una demostración de la disección (protocolo modificado 7) y la cultura de E6 explantes de la médula espinal. Nosotrosutilizan de forma habitual explantes la médula espinal para confirmar la bioactividad de las proteínas y los granos remojados en proteínas, y para verificar las especies de reactividad cruzada con los tejidos de pollo, bajo la mismas condiciones de cultivo como explantes SAG. Estos ensayos in vitro son convenientes para la rápida detección de las moléculas que ejercen trófica (supervivencia) o el trópico (direccional) efectos sobre las neuronas de la SAG, especialmente antes de la realización de estudios in vivo. Además, este método permite el ensayo de las moléculas individuales en condiciones libres de suero, con una alta supervivencia de las neuronas 8.
Protocolo
Recetas
Timbres de pollo
| 7,2 g | NaCl |
| 0,23 g | CaCl2 + 2H 2 O |
| 0,37 g | KCl |
| 0,115 g | Na 2 HPO 4 |
| 900 ml | Agua (grado de cultivo de tejidos) |
Nota: Ajustar el pH a 7.4. Alcanzar un volumen final de 1000 ml con agua.
PBS 10 veces
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 g | Na 2 HP.... |
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Discusión
Se presenta un método para analizar la cultura y la SAG E4 y E6 explantes de la médula espinal, de pollo, bajo condiciones libres de suero. Este procedimiento se utiliza actualmente en nuestro laboratorio para estudiar los efectos de diferentes ligandos secretados en la supervivencia de las neuronas SAG y crecimiento de las neuritas. Aspectos novedosos de este protocolo incluye el uso de un sistema libre de suero para los explantes de cultivo y el uso de los granos remojados en factores de crecimiento para estudiar los .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant RO1DC002756 y la Fundación de Investigación de Purdue. Damos las gracias a Doris Wu y Chang Wiese para el consejo con los experimentos y McPhail Rodney para ayudar con las cifras.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentario |
| Equipo | |||
| Disección microscopio | Nosotros usamos un microscopio estereoscópico Leica M80 con campo claro base de la iluminación | ||
| Deslice más cálido | CS & E. | Polimerización del colágeno | |
| Incubadora de huevo de gallina | |||
| 37 ° C / 5% CO 2 humidificado incubadora de cultivo celular | |||
| Materiales disección | |||
| Sylgard ycopia, revestido placa de Petri | |||
| De 24 y placa de cultivo celular | Corning | 3526 | |
| # 5 Dumont fórceps | Herramientas de Bellas Ciencia | 11252-30 | |
| # 55 Dumont fórceps | Herramientas de Bellas Ciencia | 11295-51 | |
| Pasadores de acero inoxidable de disección | Herramientas de Bellas Ciencia | 26002-10 | Embrión de la fijación, la disección fina |
| Moria cuchara perforada | Herramientas de Bellas Ciencia | 10370-17 | Embrión de la cosecha / transferencia |
| 200 l de ancho consejos boca pipeta | Punto Scientific Inc | 118-96R | Explante de transferencia |
| E4 y E6 huevos de pollo | & Nbsp; | ||
| Solución de Ringer de pollo | Embrión de la cosecha | ||
| HBSS | Sigma | H8264 | SAG disección |
| L15 | Sigma | L5520 | Disección de la médula espinal medio |
| Suero fetal bovino | Atlanta Productos Biológicos | S11150 | Disección de la médula espinal medio |
| Vannas Tijeras | Mundial de Instrumentos de Precisión | 501778 | Disección de la médula espinal |
| Colágeno preparación | |||
| De cola de rata colágeno de tipo I | BD Biosciences | 354249 | Explante cultura |
| 10X PBS (estéril) | Para neutralize colágeno | ||
| NaOH 1N (estéril) | Para neutralizar el colágeno | ||
| Agua destilada (estéril) | Para neutralizar el colágeno | ||
| papeles indicadores de pH (6.0-8.1) | Whatman | 2629-990 | Para comprobar el pH de colágeno |
| 15 ml tubos cónicos | Punto Scientific Inc | 818-PG | |
| 500 l de ancho consejos boca pipeta | Punto Scientific Inc | 119-R100 | Al colágeno pipeta |
| Explante cultura | |||
| Medio DMEM/F12 | Sigma | D8437 | Explante medio de cultivo |
| SU 1 | Sigma | I2521 | Suplemento de medio |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | Suplemento de medio |
| CNTF (rata) | Sigma | C3835 | Suplemento de medio |
| NT-3 (humanos) | Sigma | N1905 | Suplemento de medio |
| Purificada ratón Wnt5a | R & D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel azul perlas de gel | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Inmunohistoquímica | |||
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | Fijación |
| PBS | Enjuagues | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Solución de bloqueo |
| Sodioazida | Sigma | S8032 | Solución de bloqueo |
| De suero de ternera | Invitrogen | 16170-078 | Solución de bloqueo |
| Monoclonal de ratón anti-β IgG2b tubulina 1 + II de anticuerpos | Sigma | T8535 | Etiquetas de los cuerpos celulares y axones |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón de anticuerpos IgG2 b | Invitrogen | A21141 | Detecta anticuerpos β tubulina |
| Espátula de teflón micro | VWR | 57949-033 | Liberación de geles de colágeno, así |
Referencias
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.....
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Reimpresiones y permisos
