Aplicación de MassSQUIRM para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa Lisina

Resumen

Se presenta un método para el uso de espectrometría de masas MALDI y la química de la metilación reductiva para cuantificar los cambios en la metilación de la lisina.

Resumen

Recientemente, los reguladores epigenéticos se han descubierto como actores clave en muchas enfermedades diferentes ^1-3. Como resultado, estas enzimas son los principales objetivos para los estudios de moléculas pequeñas y ⁴ desarrollo de fármacos. Muchos reguladores epigenéticos sólo recientemente se han descubierto y todavía están en proceso de ser clasificados. Entre estas enzimas son desmetilasas lisina que eliminan los grupos metilo de lisinas de las histonas y otras proteínas. Debido a la naturaleza novedosa de esta clase de enzimas, ensayos de pocos se han desarrollado para estudiar su actividad. Este ha sido un obstáculo en el camino tanto para la clasificación y el estudio de alto rendimiento de desmetilasas histonas. Actualmente, los ensayos desmetilasa existen muy pocos. Las que existen tienden a ser de naturaleza cualitativa y no se puede al mismo tiempo discernir entre los estados de metilación de lisina diferentes (un-, mono-, di-y tri-). La espectrometría de masas se utiliza comúnmente para determinar la actividad desmetilasa pero los ensayos actuales de espectrometría de masasno abordar si péptidos diferencialmente metilado ionizar diferente. Ionización diferencial de péptidos metilado hace comparando los estados de metilación difícil y ciertamente no cuantitativa (Figura 1A). Así, los ensayos disponibles no están optimizados para el análisis integral de la actividad desmetilasa.

Aquí se describe un método llamado MassSQUIRM (cuantificación de espectrometría de masas utilizando metilación reductiva isotópica) que se basa en la metilación reductiva de grupos amina con formaldehído deuterado para forzar a todos lisinas ser di-metilado, lo que les hace esencialmente las mismas especies químicas y por lo tanto ionizar el misma (Figura 1B). La única diferencia química después de la metilación reductiva es hidrógeno y deuterio, que no afecta a la eficiencia de ionización MALDI. El ensayo MassSQUIRM es específico para los productos de reacción con desmetilasa lisinas un-, mono-o di-metilados. El ensayo es también aplicable a metiltransferasas lisina dando el saMe productos de reacción. Aquí, se utiliza una combinación de la química metilación reductiva y espectrometría de masa MALDI para medir la actividad de LSD1, un desmetilasa lisina capaz de eliminar di y mono-metil grupos, en un sustrato peptídico sintético ^5. Este ensayo es simple y fácilmente susceptibles a cualquier laboratorio con el acceso a un espectrómetro de masas MALDI en el laboratorio oa través de una instalación de la proteómica. El ensayo tiene ~ 8 veces el rango dinámico y es fácilmente escalable para formato de placa ^5.

Protocolo

Este protocolo se ha modificado de Blair et al. ^6.

1. LSD1 desmetilación Ensayo

1. En un volumen final de 20 l, se combinan 125 LSD1 recombinante ng con 0,25 g de di-metilo histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) en tampón desmetilasa (50 mM Tris-Cl, pH 8,5, KCl 50 mM, 5 mM de MgCl _2, 5% glicerol). Además, realizar un control de péptido solo sin enzima. El control es de la sección 3 y no necesita la metilación reductiva.
2. Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
3. Para recoger los péptidos, añadir 8 POROS l R2 20 micras perlas a cada muestra y agitar durante 15 minutos a temp....

Discusión

MassSQUIRM es un método económico y cuantitativo para el análisis integral de la actividad de la lisina desmetilasas involucrados en mono-y di-metilación. MassSQUIRM ofrece cuantificación no sólo del producto de la reacción, sino también para los productos intermedios. Este ensayo se puede utilizar como una poderosa herramienta en el estudio del mecanismo de desmetilasas histonas LSD1 y otros. También será útil para la clasificación de muchos recién descubiertos enzimas desmetilasa lisina como PHF8 y podrían ser utiliza.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
LSD1	BPS Biociencias	50100
H3K4me2-biotina péptido	Elaboración propia	ninguno
Poros R2 20 micras cuentas	Applied Biosystems	1-1129-06
C 18 ZipTip	Millipore	ZTC18M
Ácido trifluoroacético (TFA)	Thermo	28904
acetonitrilo	Pescador	A996
2,5-dihidroxibenzoico ácido	Sigma	85707
Borano de dimetilamina	Sigma	180238
isotópicamente pesada d 2-formaldehído	Cambridge Laboratorios de isótopos	DLM-805-20
Tris	Pescador	BP154
KCl	Pescador	BP366
MgCl 2	Pescador	BP214
Glicerol	Pescador	G-33
Ácido fórmico	Fluka	06440
El metanol	Pescador	A452
Fosfato de Na	Pescador	BP329
SpeedVac Concentrador	Sabio	DNA110
MALDI-prOTOF espectrómetro de masas y el software TOFworks	PerkinElmerSciex	ninguno