Para entender cómo las formas complejas de células, como las dendritas neuronales, se obtienen durante el desarrollo, es importante ser capaz de precisión organización de microtúbulos ensayo. Aquí se describe un método robusto de etiquetado inmunohistoquímico para examinar la organización de microtúbulos de las dendritas arborización dendrítica neurona sensorial, la tráquea, músculos y otros Drosophila Larva tejidos de la pared del cuerpo.
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Artículo de método
Etiquetado inmunohistológica de microtúbulos en las dendritas neurona sensorial, tráqueas y los músculos en el Drosophila Larva pared del cuerpo
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Resumen
Resumen
Para entender cómo las diferencias en las formas de células complejas se consiguen, es importante seguir con precisión la organización de los microtúbulos. El muro de las larvas de Drosophila cuerpo contiene varios tipos de células que son modelos para el estudio celular y morfogénesis de tejidos. Por ejemplo tráqueas se utilizan para examinar la morfogénesis del tubo 1, y la arborización dendrítica (DA), las neuronas sensoriales de la larva de Drosophila se han convertido en un sistema principal para el esclarecimiento de los generales y las neuronas específicas de la clase de mecanismos de diferenciación 5.2 dendríticas y degeneración 6 .
La forma de dendritas pueden variar significativamente entre las clases de neuronas, e incluso entre las diferentes ramas de una sola neurona 7,8. Los estudios genéticos en las neuronas DA sugieren que la organización del citoesqueleto diferencial puede subyacen a las diferencias morfológicas en forma de ramas dendríticas 4,9-11. Ofrecemos un método inmunológico etiquetado robusta a unssay en la organización de los microtúbulos en vivo DA sensorial cenador neurona dendrita (Figuras 1, 2, Movie 1). Este protocolo se muestra la disección y la inmunotinción de larva de primer estadio, una etapa en la actividad sensorial consecuencia dendritas neuronales y la organización de ramificación se está produciendo 12,13.
Además de la tinción de las neuronas sensoriales, este método logra el etiquetado robusto de organización de microtúbulos en los músculos (Películas 2, 3), la tráquea (Figura 3, Movie 3), y otros tejidos de la pared del cuerpo. Es valioso para los investigadores que deseen analizar la organización de microtúbulos in situ en la pared del cuerpo en la investigación de los mecanismos de control que el tejido y la forma celular.
Protocolo
1. Preparación de los reactivos
Notas antes de comenzar: la disección y la tinción inmunohistoquímica se llevan a cabo en una cámara magnética y la larva se fija por el uso de clavos de insectos de forma especial. Las instrucciones detalladas para la construcción de una cámara magnética, y la preparación de estos pines se pueden encontrar en las referencias relacionadas con 14,15. En resumen, un agujero cuadrado 1x1cm se corta en una hoja magnética y un cubreobjetos colocado en la parte posterior de la hoja para hacer una pequeña cámara. Los lados de la cámara está sellada con pegamento epóxico, después de esta c....
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Discusión
Para entender la complejidad de las formas celulares se logró es importante ser capaz de precisión organización de microtúbulos ensayo. Aquí se describe un método robusto de etiquetado inmunohistoquímico para la organización de los microtúbulos ensayo dendríticas dendritas arborización neurona sensorial. Además de la tinción de las neuronas sensoriales, este método logra tinción inmunohistoquímica robusta de la tráquea, músculos y otros tejidos de la pared del cuerpo.
Nosotros usamos este pr.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a RIKEN para su financiación. P10-Gal4 fue una especie de regalo de Alain Vicente (Université Paul Sabatier, Toulouse, Francia).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Catálogo número | Comentarios (Opcional) |
| Fórceps | Dumont | 11251-20 | |
| Microtijeras | FST | 15000-08 | |
| Mouse anti-α-tubulina (Clon: DM1A) | Sigma | T9026 | Dilución 1 / 1000 |
| Anti-ratón Futsch (Clon: 22C10), sobrenadante | De desarrollo Estudios Banco hibridoma | 22C10 | Dilución 1 / 1000 |
| Rata anti-CD8 (clon: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Dilución 1 / 1000 |
| Alexa Fluor 488 IgG anti-ratón | Invitrogen | A-11.001 | Dilución 1 / 500 |
| Cy3 anti-IgG de rata | Jackson Immunoresearch | 712-166-150 | Dilución 1 / 200 |
Referencias
- Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in....
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Reimpresiones y permisos
