Crear transitoria poros de la membrana de células utilizando una impresora de inyección de tinta estándar

Resumen

Una descripción de los métodos utilizados para convertir una impresora HP Deskjet 500 en un bioprinter. La impresora es capaz de procesar las células vivas, lo que provoca poros transitorios en la membrana. Estos poros se pueden utilizar para incorporar pequeñas moléculas, incluyendo fluorescente G-actina, en las células impresos.

Resumen

Bioprinting tiene una amplia gama de aplicaciones y la importancia, incluyendo la ingeniería de tejidos, tratamientos directos de la aplicación de células, y microfabricación biosensor. ^1.10 Recientemente, la impresión de inyección de tinta térmica se ha utilizado también para la transfección de genes ^8,9. El proceso de impresión térmica de inyección de tinta se demostró que temporalmente interrumpir las membranas celulares sin afectar la viabilidad celular. Los poros transitorios en la membrana puede ser utilizado para introducir moléculas, que de otro modo serían demasiado grandes para pasar a través de la membrana, en el citoplasma celular. ^8,9,11

La aplicación se ha demostrado aquí es el uso de impresión de inyección de tinta térmica para la incorporación de la etiqueta fluorescente g-actina monómeros en las células. La ventaja de utilizar térmica de chorro de tinta de impresión para inyectar moléculas en las células es que la técnica es relativamente benignos de las células. ^{8, 12} viabilidad de la célula después de la impresión se ha demostrado que es similar a la célula estándar PLAting métodos ^1,8. Además, la impresión de inyección de tinta puede procesar miles de células en cuestión de minutos, que es mucho más rápido que la microinyección de instrucciones. Los poros creados por impresión se han mostrado para cerrar dentro de aproximadamente dos horas. Sin embargo, existe un límite al tamaño del poro creado (~ 10 nm) con esta técnica de impresión, lo que limita la técnica para la inyección de células con proteínas pequeñas y / o partículas. ^8,9,11

Un estándar HP DeskJet 500 impresora fue modificada para permitir la impresión de la célula. ^{3, 5, 8} La cubierta de la impresora se eliminó y el mecanismo de alimentación de papel fue puenteado utilizando una palanca mecánica. Una etapa ha sido creado para permitir la colocación de láminas de microscopio y cubreobjetos directamente debajo del cabezal de impresión. Los cartuchos de tinta se abrieron, la tinta se separó y se limpian antes de su uso con las células. El patrón de la impresión se ha creado con el software de dibujo estándar, que controlaba la impresora a través de un comando de impresión simple. 3T3 fibroblastos se cultivaron hasta confluencia, se tripsinizaron y, a continuación se resuspendieron en tampón fosfato salino con solubles marcadas fluorescentemente actina G-monómeros. La suspensión celular se pipetearon en el cartucho de tinta y las líneas de células se imprimen en hojas de vidrio de cubierta de microscopio. Las células vivas son imágenes utilizando microscopía de fluorescencia y actina se encuentra en todo el citoplasma. Incorporación de actina fluorescente en la célula permite obtener imágenes de corto tiempo la dinámica del citoesqueleto y es útil para una amplia gama de aplicaciones. ^13-15

Protocolo

1. La conversión de la HP Deskjet 500

Cabe señalar que esta técnica debe trabajar con muchas impresoras de inyección de tinta comercialmente. Sin embargo, las impresoras más antiguas tienden a funcionar mejor ya que utilizan cartuchos de tinta con boquillas de mayor diámetro, los cuales no obstruir con la misma facilidad. Además, las impresoras más antiguas tienden a utilizar sensores mecánicos de alimentación de papel que son más fáciles de sortear. Las impresoras con sensores ópticos pueden ser engañados, pero con una pequeña tira de papel en el extremo más alejado de la impresora en cada ciclo, pero es un poco más difícil que el sistema mecánico de "engañar". Las impresoras actualmente disponibles en el mercado que mejor funcionan tienen una resolución baja (DPI).

Más altos de resolución de las impresoras tienden a obstruir con mayor facilidad. La resolución de la impresora HP Deskjet 500 es de 300 DPI. Hay muchas impresoras disponibles en el mercado (HP Deskjet serie y otros) que tienen una resolución de 600 DPI. Este tipo de impresora se puede utilizar con sólo un pequeño aumento en la boquillaobstrucción de las cuestiones que pueden aliviarse con una limpieza cuidadosa (sección 3).

1. Quite la cubierta superior de plástico de la impresora mediante el desbloqueo de algunos clips de plástico de la base inferior de la impresora y levantando lentamente la parte superior fuera.
2. Desenrosque el botón / luz de la pantalla del panel de la parte superior de la impresora, dejándolo conectado a la placa base de la impresora.
3. Limpiar el interior de la impresora, especialmente las áreas donde se asienta el cartucho de tinta y donde se produce la impresión.
4. Ubique los cables que suministran energía a los mecanismos de alimentación de papel y desconectar de la placa base.
   1. En el HP DeskJet 500, éstos se encuentran justo debajo de la bandeja de papel hacia la izquierda de la parte delantera.
5. Busque mecanismo de detección de papel. Omitir el mecanismo de fijación por una cuerda o lazo de alambre para servir como un mango de tracción manual.
   1. En el HP DeskJet 500, el mecanismo de detección de papel es una palanca de plástico gris encuentra por encima y detrás del mecanismo de alimentación de impresión / papel.
6. Crear un escenario delante del mecanismo de alimentación de papel (donde el papel se alimenta desde y depositados) con el fin de llevar las diapositivas de impresión deseados a un nivel justo por debajo del cabezal de impresión del cartucho.
   1. Para nuestros experimentos, el titular de embalaje de espuma para los tubos de 15 ml de centrífuga se utiliza con varios portaobjetos en el lugar correspondiente en la región de impresión para que el nivel final de las diapositivas a la altura deseada.
7. Para mantener la técnica aséptica, la impresora puede ser colocada dentro de un gabinete estándar de riesgo biológico o una campana de flujo laminar de mesa.
8. Es importante señalar que la modificación de un comercialmente disponible de chorro de tinta por lo general se anulará la garantía de la impresora fabricante.

2. Conversión de las imágenes de archivo cartuchos de tinta HP (HP 26 cartucho de tinta Negro)

1. Retire el cartucho de su embalaje, dejando la cinta protectora que cubre los contactos de la impresora y el cabezal de impresión, por el momento.
2. Estabilizar el cuerpodel cartucho (parte de color negro) o bien con una pinza o tornillo de banco (simplemente toma firmemente el cartucho de la mano por lo general funcionado tan bien), dejando el verde claro encima de cualquier obstáculo.
3. Con unos alicates o una llave ajustable, tome la parte superior verde bajo el cartucho y gire hacia atrás y adelante varias veces hasta que se libera.
   1. Esto no debería tener mucha fuerza, pero la parte superior ya no es necesaria, por lo que está bien si se rompe al sacarlo.
4. Uso de destornilladores, saque la pieza de plástico transparente ahora expuestos.
   1. Una vez más, esto no debería tener mucha fuerza, pero no será necesaria, por lo que está bien si se rompe durante la extracción.
5. Vacíe cualquier resto del depósito.
6. Retire la cinta protectora de plástico que cubre los contactos de la impresora y la cabeza de impresión.
7. Lavar los depósitos con agua.
   1. Utilice una pipeta o una jeringa para empujar el agua a través de los canales.
   2. El agua es probable que escape de la cabeza de impresión duranteeste proceso, lo que es aceptable, y no causa ningún daño a la funcionalidad del cartucho.
8. Cuando el agua salga clara, permita que el cartucho se seque.

3. Limpieza de cartuchos de tinta

1. A fin de mantener un ambiente de impresión limpio, el cartucho de tinta debe ser limpiado antes y después del uso.
   1. Esto también ayuda a evitar la cristalización de las sales y otros materiales biológicos en el cartucho que podrían causar obstrucciones.
2. Totalmente sumergir el cartucho en un vaso lleno de agua desionizada, y sonicar durante 15 minutos antes y después de la impresión.
3. Después de ultrasonidos, retire el cartucho del agua, y sacuda el exceso de agua.
4. Aerosol etanol 70% en el cartucho para crear un ambiente más aséptico.
   1. Asegúrese de que el etanol se ha secado antes de añadir la solución de impresión bioink.

4. Hacer que la suspensión de la célula - "Biotinta "

1. Las células de cultivo hasta el momento de pasaje.
   1. Para los fibroblastos 3T3: las células de semillas en matraces T-75 a unos 1.3x10 ⁴ células / cm ² en Dulbeccos Eagles medio modificado (DMEM) con suero fetal bovino al 10% (FBS). Las células de cultivo para dos días en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
2. Hacer fluorescente g-actina solución madre a una concentración de 50 ug / ml en solución tampón de fosfato (PBS).
3. Las células de paso.
   1. Para los fibroblastos 3T3: Quite el papel del matraz y enjuagar dos veces con PBS. Cubrir las células con 5 ml de 0,25% de tripsina + EDTA y se incuba durante 5 minutos.
   2. Añadir 5 ml de medio fresco y pipetear la suspensión de células en un tubo de 15 ml de centrífuga cónico y centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Aspirar pasado medio.
4. Resuspender las células en PBS con una solución fluorescente de acciones del G-actina para crear bioink.
   1. Bioink debe tener una concentración final de g-actina de 10 ug / ml y un co célulancentration de 1x10 ⁵ células / ml. Esta concentración se ha optimizado para limitar la cantidad de células por gota y la obstrucción de la cabeza impresora. ⁸
   2. Nótese que 250 l de bioink imprime tres cubreobjetos con el modelo mostrado en la Figura 2.

5. Bioprinting

1. Encienda la impresora y deje que se caliente.
2. Lugar deseado superficie de impresión (aquí, se utiliza 22 mm x 22 mm cubreobjetos) en el centro de la etapa preparada en la etapa 1.6.
3. Crear un archivo de patrones de impresión.
   1. Abra Microsoft Word (o cualquier otro software de dibujo), y dibujar el patrón deseado.
   2. Elija un patrón de impresión deseada para la impresión de células en el archivo preparado de antemano.
4. Cargar el cartucho preparado con suspensión celular deseada.
   1. Pipeta suspensión en la circular pequeñas bien en la parte inferior del compartimento de cartucho. Utilice aproximadamente 100-120 l de solución. El tamaño de la gota impreso es de alrededor de 130⁸ picolitros.
5. Imprimir el archivo con la impresora HP Deskjet 500.
   1. Para obtener los mejores resultados, imprima los patrones más pequeños varias veces (5), cambiando la cantidad de copias que desea en el programa de procesamiento de textos.
6. La impresora se caliente de nuevo, a continuación, el cartucho se moverá a la "posición de arranque".
7. Cuando el cartucho se mueve hacia la posición de preparado (un poco a la izquierda de que el goteo de tinta muy por debajo y se queda allí), tire hacia arriba del alambre de mecanismo de alimentación de papel y la impresión comenzará debe.
   1. Para obtener copias múltiples de la impresión, el mecanismo de alimentación de papel tendrá que ser liberada después de cada ciclo o página impresa. El cartucho y luego volverá a la "lista" de posición, y el cable de alimentación de papel mecanismo debe ser levantado otra vez.
8. La impresora imprime en el cubreobjetos colocado en el centro de la etapa de impresión en el paso 5,2 (ver Figura 2).

6. Resultados representativos

Los resultados representativos del proceso de conversión de un Deskjet serie, fuera de la plataforma HP-500, estándar HP 26 cartuchos de la serie va a crear una impresora con la capacidad de las soluciones de impresión móviles para muchos tipos de análisis como se dijo antes. La impresora completado después de la conversión se muestra en la Figura 3, con una etapa de impresión para colocar el cubreobjetos sobre microscopio. La impresora puede ser útil en el análisis en muchos campos, incluyendo pero no limitados a: la mecánica de células individuales, ingeniería de tejidos, transfección génica, micropatterning biosensor, y terapias directas de células ^{1-10, 16-22.}

En este ejemplo, una impresora HP Deskjet 500 y HP 26 cartuchos de tinta de la serie se modificaron para bioprinting. Utilizando esta configuración de la impresora con un bioink que consta de una suspensión de células de fibroblastos en una solución de monómero g-actina, las células se imprimen sobre cubreobjetos de vidrio para microscopio. Figura 1 ilustra RES representativos ULTS de células de fibroblastos impresos, que muestran incorporados monómeros de actina fluorescentes. Los resultados se obtuvieron en un ambiente controlado aséptico en la cual las células se imprimen en patrones adaptable.

El patrón usado en este ejemplo fue creado en Microsoft Word (Figura 2). Este patrón creado una línea continua de la solución de impresión a través de la mayoría de los portaobjetos de microscopio. Figura 4 muestra la línea recta en la que están mutuamente la bioink y las células depositadas. Cabe señalar que, inmediatamente después de la impresión, hay un aumento de la fluorescencia de fondo porque la solución bioink, en el que las células se suspenden, contiene monómeros libres de exceso de actina fluorescentes. Esta fluorescencia de fondo disminuye significativamente tras la adición de medios de crecimiento en las células (Figura 1), que se lava el exceso de monómero a partir del sustrato.

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Figura 1. Las imágenes representativas de los fibroblastos 3T3 3 horas después de la impresión utilizando la impresora de inyección de tinta modificado. El interior de las células muestran incorporados marcado con fluorescencia monómeros de actina. Las barras de escala representan 50 micras.

Figura 2. Diseño utilizado para imprimir bioink.

Figura 3. De la impresora después de la conversión con la etapa de espuma de poliestireno. El cable de color naranja en el medio no pasa por el sensor de la palanca de alimentación de papel.

Figura 4. Imagen representativa de los fibroblastos 3T3 impresas en una zona de impresión localizada. Imagen de microscopía toma 5 minutos después de la impresión a 20x de aumento.

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Figura 5. La imagen de fluorescencia (40x) se toma 3 horas después de la impresión que muestra un fibroblasto con internalizadas monómeros de actina fluorescente. Barra de escala representa 50 micras.

Figura 6. Microscopía de fluorescencia (20 aumentos) de una célula tomada 15 minutos después de la impresión. La imagen muestra el G-actina (verde) y el núcleo (azul). De izquierda a derecha: g-actina con Alexa Fluor 488, el núcleo con DAPI, y una superposición de ambos.

Figura 7. Microscopía fluorescente que muestra dos fibroblastos en un patrón de línea 3 horas después de la impresión. Imagen a la izquierda muestra la etiqueta fluorescente monómeros de actina dentro de las células. Imagen de la derecha es una superposición del canal fluorescente con la imagen de fondo para mostrar que a pesar depuede haber algunos restos de la diapositiva (en la esquina inferior izquierda), no fluorescente. Las barras de escala representan 50 micras, si no se indica el tamaño de la extrema derecha es un grupo control de no impresas las células se incubaron durante 3 horas con monómeros marcado con fluorescencia. Este control es mostrar que los monómeros no podía penetrar la membrana celular sin permeabilización de la membrana celular mediante impresión.

Discusión

El proceso para convertir una impresora de inyección de tinta de escritorio estándar para bioprinting no es particularmente difícil. El paso más difícil es determinar la manera de eludir el mecanismo de alimentación de papel, que depende de la marca y modelo de impresora utilizado. Sin embargo, esto es relativamente simple cuando el sensor de alimentación de papel es mecánico como se describe aquí. Para los modelos con sensores ópticos de alimentación, otras técnicas puede ser necesario emplear para engañar a la impresora para que piense que es el uso de papel, por ejemplo, uno puede ejecutar un pequeño trozo de papel a través de la impresora mientras se imprime en el portaobjetos de un microscopio. Sin pasar por el mecanismo de alimentación de papel es probable que sea el paso más difícil en la aplicación de estos procedimientos para modelos de impresoras diferentes.

Cuando se construye una etapa para mantener los cubreobjetos para la impresión, es importante para asegurar la alineación apropiada y la altura. La etapa debería permitir el cubreobjetos para ser colocado en el centro del área de impresión. Además, se debe plel as de los cubreobjetos a una altura adecuada para dejar espacio para el cartucho de impresión para pasar por encima de la diapositiva sin interrumpir la misma. La altura exacta de la etapa dependerá del modelo de impresora.

Para asegurar que las células impresas no se lavan lejos, los portaobjetos se colocaron en una incubadora inmediatamente después de la impresión durante aproximadamente 30 minutos para permitir la fijación de las células antes adicionales medios de crecimiento de células se añadió. Debido a que las células fueron impresos en una solución que incluye grandes cantidades de PBS las células no se secan y se mantuvo viable. Las células fueron imágenes mediante microscopía de fluorescencia para visualizar la distribución de los etiquetados actina G-monómeros dentro de la célula (Figuras 1, 5-7). Cuando se imprime con fibroblastos 3T3, la Figura 5 muestra un resultado representativo, con la actina causando gran parte de la célula para fluorescencia, pero mostrando las líneas de brillo mayor. La incorporación de etiquetado fluorescente g-actina en el citoesqueleto esútil para el estudio de la dinámica del citoesqueleto y mecánicos celulares. ^12-15 Una limitación de esta técnica es que sólo es aplicable para las moléculas y proteínas que tienen diámetros menores de aproximadamente 10 nm.

Para asegurar que las células estaban siendo procesada por la impresora convertido, DAPI (1:5000 en PBS) se añadió a la bioink en lugar de la mitad del volumen de PBS puro. La mancha fluorescente DAPI se une a las porciones de aminoácidos ricos de ADN localizadas en el núcleo. Por lo tanto DAPI es un útil mancha en los núcleos de imágenes con fluorescencia de las células impresos. La figura 6 muestra una imagen representativa de una célula mostrando tanto Alexa Fluor 488 (actina) y DAPI (núcleo) de fluorescencia con una imagen de superposición de ambos. Figura 7 ilustra también cómo las células fluorescentes una vez que los monómeros de actina G-se han incorporado mientras que los no-material biológico que ha sido depositado en la muestra no presenta fluorescencia debido a la absence de G-actina monómeros.

Una consideración importante para bioprinting es el medio acuoso que se utilizan para la bioink. Se encontró que el uso de medios estándar de crecimiento de células con suero producido resultados inconsistentes. Esto es más probable debido a la obstrucción de los inyectores del cabezal de impresión por parte de las proteínas séricas. El uso de PBS aumentó la consistencia de los patrones impresos y depositado el número de células. Una desventaja de usar PBS es que las células no se debe dejar en la suspensión durante períodos prolongados de tiempo. Sin embargo, los fibroblastos en estos ejemplos fueron capaces de tolerar las condiciones bioink por lo menos una hora sin ningún cambio en la viabilidad celular. Esto es consistente con varios hallazgos anteriores, que dan cuenta de que las células impresos a través de los mecanismos de inyección de tinta térmica se ha demostrado que tienen altos índices de viabilidad. ^2-8

Esta configuración de la impresora modificado puede ser utilizado para otras aplicaciones de impresión de la célula. ^16-22 proteínas de la matriz, tales como colágeno o fibroneCTIN, se pueden imprimir fácilmente sobre sustratos con esta técnica, que pueden ser útiles para el patrón celular. Para el tipo de colágeno ejemplo, yo impresa en patrones de líneas se traducirá en sustratos de colágeno alineadas que pueden ser utilizados para estudios in vitro de cultivo celular. ¹⁷ Además de las proteínas de la matriz, otras moléculas, incluyendo factores de crecimiento, pueden ser localizados de forma fiable sobre sustratos para los estudios de células y las posibles aplicaciones terapéuticas. ¹⁸

Una limitación importante del diseño descrito en los pasos anteriores es que esta impresora no es capaz de imprimir en más de una dimensión. Esto limita el potencial para su uso en aplicaciones tales como la impresión estampadas andamio. Para permitir la impresión en 3D, una etapa especializado necesita ser utilizado. La etapa necesita tener ajustes incrementales de altura para deposición de capa por capa de bioink.

Bioprinting ha mostrado prometedor como un método eficiente y rentable para la ingeniería de tejidos, El gen de la transfección, micropatterning y la fabricación de microarrays de ^{1-12, 16-22} Las futuras aplicaciones de este tipo de dispositivos son numerosos, incluyendo:. Creación de microambientes controlados y con diseños celulares, la incorporación de macromoléculas en el citoplasma de la célula, y la deposición de las células en los andamios y las estructuras que no se producen de forma natural o de manera eficiente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HP Deskjet 500	Hewlett-Packard	C2106A	Descontinuado por el fabricante. Comprado reformado Trader diciembre
HP 26 Negro Cartucho de tinta	Hewlett-Packard	51626A
La actina de músculo de conejo, Alexa Fluor 488 conjugada, 200 ug	Invitrogen	A12373
Tampón fosfato salino (PBS)	MP Biomedicals	ICN1860454
Dulbecco modificado Eagles (DMEM)	Thermo Scientific	SH3002201
Suero Bovino Fetal	Sigma-Aldrich	F4135
La anfotericina B	Sigma-Aldrich	A2942	Se utiliza en el 0,5% en medios de cultivo celular
La penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333	Se utiliza en el 0,5% en medios de cultivo celular
Banco de flujo unidireccional Limpio	Envirco	VLF 797	Carcasa opcional para mantener la impresora aséptica