El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

Resumen

Este protocolo de vídeo demuestra un método novedoso para la generación y la posterior purificación de las células progenitoras neuronales de una fuente renovable de células madre neurales (NSC) en base a su físico (granularidad tamaño e interna) y las propiedades fluorescentes utilizando la tecnología de citometría de flujo.

Resumen

Las células madre neurales (NSC) puede aislarse y ampliado en gran escala, utilizando el ensayo neuroesfera y diferenciado en los tres tipos principales de células del sistema nervioso central (SNC), a saber, los astrocitos, oligodendrocitos y neuronas. Estas características hacen de madre neurales y las células progenitoras de una valiosa fuente renovable de células para estudios in vitro, tales como la detección de drogas, neurotoxicología y electrofisiología y también para la terapia de reemplazo celular en muchas enfermedades neurológicas. En la práctica, sin embargo, la heterogeneidad de la progenie Consejo de Seguridad Nacional, la baja producción de neuronas y oligodendrocitos, y el predominio de los astrocitos después de la diferenciación limitan sus aplicaciones clínicas. Aquí se describe una nueva metodología para la purificación de la generación y posterior de las neuronas inmaduras de la progenie NSC murino utilizando fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de tecnología. Utilizando esta metodología, una población neuronal altamente enriquecido de células progenitoras se puede lograr el ingenioHout cualquier astrocito y la contaminación notable de buena fe Consejo de Seguridad Nacional. El procedimiento incluye la diferenciación de la progenie NSC aislaron y expandieron desde E14 eminencias ratón ganglionares utilizando el ensayo neuroesfera, seguido por aislamiento y enriquecimiento de las células neuronales inmaduras en base a sus propiedades físicas (tamaño y complejidad interna) y fluorescente utilizando la tecnología de citometría de flujo. En general, se tarda 5-7 días para generar neuroesferas y los días 6-8 de diferenciar la progenie Consejo de Seguridad Nacional y aislar altamente purificado las células neuronales inmaduras.

Protocolo

1. Configuración básica Antes de proceder a la cultura de la célula

1. NeuroCult Medio Basal y NSC NeuroCult Suplementos NSC proliferación se mezclan en una proporción 9:1, respectivamente, para hacer medio completo NSC.
2. Un baño de agua 37 ° C se utiliza para calentar el medio.
3. Cantidad apropiada de calor inactiva suero fetal bovino (FCS) se descongela.
4. Cantidad apropiada de las soluciones madre de factor de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento epidérmico (EGF a 10 g / ml), factor de crecimiento básico de fibroblastos (b-FGF en 10 g / ml) y 0,2% de solución de heparina en tampón fosfato salino (PBS) se descongelan.

Discusión

La capacidad de aislar las poblaciones definidas de células neuronales (neuronas, es decir, astrocitos y oligodendrocitos) podría resolver algunos de los impedimentos asociados con la aplicación clínica de células madre neurales (NSC). En primer lugar, nos permite caracterizar completamente la población a partir de las células del donante. En segundo lugar, nos permite utilizar un tipo de célula particular, o una combinación de diferentes tipos de células con una proporción específica, dependiendo de la naturaleza o la .......

Materiales

Nombre del reactivo	Tipo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NeuroCult NSC Medio Basal	Medio	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC proliferación Suplementos	Suplemento Medio	Stem Cell Technologies	05701
0,05% de tripsina-EDTA	Reactivo	Gibco	25300-062
Inhibidor de tripsina de soja	Reactivo	Sigma	T6522
Pen / Strep	Reactivo	Gibco	15140-122
* MEM	Reactivo	Gibco	41500-018	HEM componente
* Los HEPES	Reactivo	Sigma	H4034	HEM componente
* Agua destilada	Reactivo	Gibco	15230-147
Cell colador	Tamiz	BD Falcon	352340
T25 frasco	Cultura de la cerámica	Nalge Nunc internacional	136196
T80 frasco	Cultura de la cerámica	Nalge Nunc internacional	178905
15 ml tubos	Cultura de la cerámica	BD Falcon	352096
50 ml tubos	Cultura de la cerámica	BD Falcon	352070
EGF	Factor de crecimiento	I + D	2028-EG
b-FGF	Factor de crecimiento	I + D	3139-FB
La heparina	Factor de crecimiento	Sigma	H4784	Reconstituido en PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	Anticuerpo	Miltenyi Biotec	130-093-274
PE-IgG1 de ratón conjugado	Isotipo del anticuerpo de control	BD Pharminogen	556029
La heparina	Factor de crecimiento	Sigma	H4784	Reconstituido en PBS
HrBMP-4	Factor de crecimiento	I + D	314-BP-010
Poli-L-OrnitHine	Reactivo	Sigma	P4957
De suero fetal bovino	Suplemento Media	Gibco	10099-141
GFAP	Anticuerpo	Dako	Z0334
B-III tubulina	Anticuerpo	Promega	G7121

* Para hacer el dobladillo, mezcle 1 x paquete de 10 l de MEM y 160 ml de HEPES 1M y obtener un volumen de 8,75 L con agua destilada. Ajuste el pH final de 7,4 y almacenar a 4 ° C.