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1. El aislamiento y la estimulación de las células inmunes
- Obtener 10-50 ml de sangre heparinizada de voluntarios sanos después de consentimiento informado por escrito en virtud de las directrices de la Junta de Revisión Institucional local. Para los estudios de envejecimiento o la enfermedad de la patogénesis, la exclusión y los criterios de inclusión para cada voluntario o el paciente tiene que determinarán de forma expresa.
- Aislar las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) con CPT o tubos de Ficoll Paque-Plus de acuerdo a las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, NJ) y realizar experimentos en el día de aislamiento 7 (reactivos, tabla 1).
- Incubar PBMC (3 x 10 6 / tubo) en tubos de 1,5 ml en medio 0,6 ml solos o estimulados con ligandos TLR u otros agentes activantes, por ejemplo, el ligando TLR7 / 8 R848 (0,6 ml de medio, más 0,6 l de 10 mM de TLR7 / 8 ligando R848, concentración final 10 mM) a 37 ° C durante 10-60 minutos (Invivogen, CA) 9.
2. LaboratorioEling de las células
- Etiqueta de linaje celular y otros marcadores de superficie en las suspensiones de células vivas con fluorescencia utilizando anticuerpos conjugados. Etiqueta 3 x 10 6 PBMC durante 20 min a 4 ° C en 100 l de PBS / 2% de FBS en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con un cóctel de anticuerpos específicos de superficie para los linajes de monocitos o DC (Tabla 2). Diluciones óptimas de anticuerpos se puede determinar en experimentos preliminares y las muestras deben ser procesados en lotes para minimizar lote a lote variación. Para la acción vendedor anticuerpo de 0,1 mg / ml de usar 5 l de anticuerpo (1:20 dilución). Utilizar un tubo separado de las células marcadas con sólo un conjugado de un solo color para configurar los canales fluorescentes en el instrumento.
- Después de etiquetado superficie, fijar las células en PFA 4% / PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Para el almacenamiento hasta el momento del análisis, las células centrifugar a 500 xg, y volver a suspender las células en tampón de congelación (90% de FBS que contiene 10% de DMSO) a -80 ° C hasta que el día de ensayo.
- Para la evaluación, el proceso de lotes of células no tratadas y estimulado de un grupo de donantes a fin de minimizar la variabilidad. En el día de análisis, las células descongelación rápida en 37 ° C baño de agua, se centrifuga a 500x g para eliminar tampón de congelación.
- Para permeabilizar las células para la detección de citoquinas intracelulares u otros marcadores, suspensiones volver a suspender las células en 100 l BD Perm / Wash buffer (BD Biosciences, NJ). Etiqueta para los componentes intracelulares de señalización con, por ejemplo, una dilución de 1:20 de conejo anti-NF-kB (p65), anticuerpo (concentración final de 10 mg / ml, Santacruz Biotechnology, CA) durante 20 min a temperatura ambiente, se centrifuga a 500 xg, sobrenadante aspirado y Resuspender las células en 100 Perm BD l / tampón de lavado que contiene 1:250 dilución de cabra anti-IgG de conejo-Alexa647 (Invitrogen, CA) y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente.
- Inmediatamente antes de la formación de imágenes, contratinción núcleos con DAPI (0,2 g / ml, Invitrogen, CA) o yoduro de propidio (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA).
3. Análisis IMAGESTREAM
- Llevar a cabo por la imagen IMAGESTREAM en muestras de lotes para reducir la variabilidad entre las muestras humanas. Ajuste del equipo para poder de los láseres fueron como sigue: 200 mW para 488 nm, 10 mW para 658 nm y 250 mW para 405 nm.
- Para el análisis de archivos de datos (Fig. 1), en primer lugar, la puerta de eventos con la intensidad de PI normal y alta relación de aspecto de PI (ancho: relación altura) para distinguir células individuales (R1) de los desechos (de baja intensidad PI) o los eventos multi-celulares ( PI de alta intensidad y baja relación de aspecto). Los monocitos se encuentran dentro de una puerta para células CD14 positivas. mDCs se encuentran dentro de una puerta de las celdas que tienen un alto contenido de CD11c y bajo de CD4 (R2) y baja también por Lin-1 marcadores (R3).
- Utilizar ideas de software (Amnis, WA) para proporcionar una medida eficaz cuantitativa del grado de activación de cada celda. Determinar la similitud (o co-localización) del factor de transcripción NF-kB citoplasmática con la energía nuclear tinte de PI para indicar la translocación en el núcleo (R4). Una alta correlación de NF-κB/PI localización se refleja en una puntuación de similitud elevada e indica el grado de activación 10.
- Comparar los índices de similitud entre los diferentes grupos de tratamiento o poblaciones de pacientes para indicar la eficiencia relativa funcional de las células. Cuantificar los datos entre las muestras a través de la comparación estadística de los valores absolutos o las diferencias de plegado. Utilice el software de IDEAS para mostrar imágenes de las células de los principales segmentos de la población de histogramas (Fig. 2).
4. Los resultados representativos
Hemos cuantificado vías de señalización en respuesta a un ligando modelo viral mediante la estimulación de PBMC con el ligando TLR7 / 8, R848 (fig. 1). Se recogieron las dos imágenes de localización de celulares y las estadísticas de población en los grupos de la muestra (Fig. 2). IMAGESTREAM nos permite subconjuntos de células de puerta directamente de CMSP y las respuestas de imágenes de células de las poblaciones de células cerradas, pero sin clasificar. Aquí hemos cuantificado el efecto de los TLR signaling en la localización nuclear de NF-kB (p65) en Lin1-, CD4 tenue, CD11c + DCs mieloides (mDCs). Al inicio del estudio, se observó un alto porcentaje de células no estimuladas con el factor de transcripción NF-kB (p65) en el citoplasma. Después de la estimulación, las células tratadas tienen una puntuación significativamente más alta similitud de NF-B (p65) con PI tinción nuclear, lo que indica que el NF-kB (p65) trasladadas en el núcleo después de la estimulación (mediana de las puntuaciones de similitud son 1,52 y 3,01, respectivamente, la figura. 2). Resultados similares se observan en TLR5 estimulados monocitos 9.
Figura 1. Tinción y estrategia de apertura de puerta para cuantificar los efectos de la estimulación en mDCs humanos. El factor de transcripción NF-kB regula la expresión de numerosos genes del sistema inmunológico. Este estudio mide la localización nuclear de NF-kB (p65) en mDCs sujeto representativo de uno después de TLR7 / 8 liga ª estimulación. En foco las células individuales fueron identificados por la compuerta de PI eventos positivos con altas proporciones de aspecto nucleares (R1). mDCs (Lin1, CD4dim, CD11c +) fueron cerrada en R3. Localización nuclear de NF-kB (p65) se representa en la R4. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. . La translocación de NF-kB en mDCs después de la estimulación La translocación de NF-kB (p65) en el núcleo después de la estimulación (R4) se representa en las poblaciones de mDCs no tratados y estimulados, la puntuación de similitud promedio es de 1,52 en la muestra sin tratar y 3,01 en el la muestra estimulada (A). Las imágenes digitales recogidas de forma simultánea de las poblaciones de células no tratadas o R848 estimulados muestran células representativas y la intensidad de NF-B trasladadas en el núcleo de la célula (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande figura.