GC-basado en la detección de ácido Aldononitrile acetato derivado de glucosamina y murámico de la determinación de residuos microbiana en el suelo

Resumen

Se describe un protocolo método para el análisis de GC-basada de los derivados aldonitrile acetato de glucosamina y ácido murámico extraída del suelo. Para esclarecer el mecanismo químico, también presentan una estrategia para confirmar la estructura del derivado y los fragmentos de iones formados en la ionización de electrones.

Resumen

Los enfoques cuantitativos que caracterizan a los microorganismos son cruciales para una comprensión más amplia de la situación y función microbiana dentro de los ecosistemas. Las estrategias actuales para el análisis microbiológico de laboratorio incluyen tanto los tradicionales que dependen de la cultura y las técnicas basadas en la extracción directa y la determinación de ciertos biomarcadores ^{1 y 2.} Pocos entre la diversidad de especies microbianas que habitan en el suelo pueden ser cultivadas, por lo que dependen de la cultura-los métodos de introducir sesgos significativos, una limitación ausente en el análisis de biomarcadores.

El ácido de glucosamina, manosamina, galactosamina y murámico han sido bien servido como medidas tanto de los vivos y los muertos masa microbiana, de ellos el ácido glucosamina (más abundante) y murámico (únicamente a partir de células bacterianas) son los componentes más importantes en los sistemas de suelo ^{3 , 4.} Sin embargo, la falta de conocimiento en el análisis restringe la divulgación amplia de los pares científicos. Entre todas las exipicadura de los métodos analíticos, la derivación de aldononitrile acetatos seguido por GC-basado en el análisis se ha convertido en una buena opción con respecto al óptimo equilibrio entre precisión, sensibilidad, sencillez, buena separación cromatográfica, y la estabilidad en el almacenamiento de la muestra ^5.

A continuación, presentamos un protocolo detallado para un análisis fiable y relativamente simple de la glucosamina y ácido murámico del suelo después de su conversión al acetatos aldononitrile. El protocolo comprende principalmente cuatro pasos: digestión ácida, la purificación de la muestra, la derivatización y la determinación de GC. El procedimiento paso a paso se modifica de acuerdo con el ex publicaciones ^{6, 7.} Además, se presenta una estrategia para validar la estructura del ion molecular del derivado y sus fragmentos de iones formados en la ionización de electrones. Se aplicaron GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS y reactivos marcados con isótopos para determinar el peso molecular de acetato derivado aldononitrile la glucosamina y el murácido amídico, se utilizó el cambio de masa de isótopos marcados derivados en el espectro de iones para investigar los fragmentos de iones derivados de cada ^8. Además de la elucidación teórica, la validación de ión molecular del derivado y sus fragmentos de iones será útil para los investigadores que utilizan δ ¹³ C o fragmentos de iones de estos biomarcadores en estudios bioquímicos ^{9, 10.}

Protocolo

1. Preparación de la muestra y la extracción de ácido

1. Liofilizar las muestras de suelo después de la recolección de campo.
2. Triturar y homogeneizar muestras de suelo utilizando un molino de bolas, molino de suelo, o un mortero y almirez.
3. Pesar muestras de suelo (que contiene> 0,3 mg de N) en un matraz de 25 ml hidrólisis.
4. Añadir 10 ml de HCl 6 M en cada frasco de la hidrólisis, llene N ₂ gas en los frascos, y la tapa.
5. Hidrolizar a 105 ° C en una incubadora durante 8 horas utilizando un interruptor de tiempo automático.

2. Purificación de la muestra

1. Retirar los f....

Discusión

El GC presentó basado en el método para el análisis de ácido aldononitrile acetato derivado de glucosamina y murámico proporciona un método relativamente rápido para cuantificar los aminoácidos, los azúcares extraídos del suelo. Los derivados son químicamente estables, y se puede determinar en un análisis. El método no se limita a las muestras de suelo, y puede ser simplificado para muestras de matriz no-suelo.

La bomba de vacío utilizado en este método está construido para ser resistente al.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Ácido murámico	Sigma-Aldrich	M2503-25MG
D-(+)-glucosamina clorhidrato	Sigma-Aldrich	G1514-100G
N-metil-D-glucamina	Sigma-Aldrich	M2004-500G
Myo-inositol	Fisher Scientific	A307003G025
El metanol (seco)	Acros orgánicos	AC326950010
4-dimetilamino-piridina	Acros orgánicos	AC148270050
Acetato de etilo	VWR International	BJGC100-4
Hydroxlamine clorhidrato de	Fisher Scientific	H330-100
Piridina	Fisher Scientific	P368-500
El anhídrido acético	Fisher Scientific	A10-100
Diclorometano (cloruro de metileno)	Fisher Scientific	D37-500
Hexano	Fisher Scientific	H303-4
El ácido clorhídrico (6 M)	Fisher Scientific	S456-4
Hidroxilamina clorhidrato de N -15	Icono de los servicios	IN5280
Anhídrido acético -2 H (D 6 C 4 O 3)	Acros orgánicos	AC174670050
D-glucosa-U -13 C	Cambridge laboratorio de isótopos	CLM-1396-1
Amonio sufate -15 N	Cambridge laboratorio de isótopos	NLM-713-1
Nombre del equipo	Empresa	Tipo
Rapid-Vap	Labconco	790002
Vacum bomba	KNF Neuberger	D-79112
La hidrólisis frasco	Fisher Scientific	06 423A
Derivatización microvial	Fisher Scientific	06-100E
GC	Hewlett-Packard	6890
MS	Hewlett-Packard	5972
LC-ESI-TOF-MS	Agilent	Un sistema de la serie 1200 de Agilent HPLC acoplado a un LC Agilent / MSD TOF-