Artículo de método

Simples dispositivos de microfluidos para

DOI:

10.3791/3780

⸱

30 de septiembre de 2012

 ,  , 
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

En este artículo

Resumen

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Un dispositivo microfluídico simple ha sido desarrollado para realizar anestésico libre In vivo Formación de imágenes de C. elegans, Intacto Drosophila Larvas y larvas de pez cebra. El dispositivo utiliza una membrana de PDMS deformable para inmovilizar estos organismos modelo con el fin de realizar las imágenes de lapso de tiempo de numerosos procesos, tales como el ritmo cardíaco, la división celular y subcelular transporte neuronal. Se demuestra el uso de este dispositivo y muestran ejemplos de diferentes tipos de datos recogidos a partir de sistemas de modelos diferentes.

Resumen

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Micro fabricadas dispositivos fluídicos proporcionar un micro-entorno accesible para estudios in vivo de pequeños organismos. Procesos de fabricación sencillos están disponibles para los dispositivos de microfluidos con técnicas de litografía blanda 1-3. Los dispositivos microfluídicos se han usado para la sub-celular de imagen 4,5, in vivo microcirugía láser 2,6 y 4,7 celular formación de imágenes. Imágenes in vivo requiere la inmovilización de los organismos. Esto se ha logrado mediante succión 5,8, 6,7,9 canales cónicos, membranas deformables 2-4,10, succión con refrigeración adicional 5, anestésico gas 11, geles sensibles a la temperatura 12, 13 y pegamento de cianoacrilato anestésicos tales como levamisol 14 , 15. Anestésicos usados ​​comúnmente influir en la transmisión sináptica 16,17 y se sabe que tienen efectos perjudiciales sobre la sub-celular neuronal transporte 4. En este study demostramos una membrana basada poli-dimetil-siloxano (PDMS), dispositivo que permite la inmovilización anestésico libre de organismos modelo intactas genéticos tales como Caenorhabditis elegans (C. elegans), larvas de Drosophila y larvas de pez cebra. Estos organismos modelo son adecuados para estudios in vivo en los dispositivos de microfluidos a causa de sus pequeños diámetros y cuerpos ópticamente transparentes o translúcidos. Diámetros del cuerpo van desde ~ 10 ~ 800 micras para micras para los primeros estadios larvales de C. elegans y larvas de pez cebra y requieren dispositivos de microfluidos de diferentes tamaños para lograr una inmovilización completa de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo. Estos organismos se inmovilizan mediante presión aplicada por gas nitrógeno comprimido a través de una columna de líquido y fotografiado usando un microscopio invertido. Animales liberados de la trampa de volver a la locomoción normal dentro de 10 min.

Demostramos cuatro aplicaciones de time-lapse en C. elegansa saber, el transporte mitocondrial de imágenes en las neuronas, presináptica transporte de vesículas en un transporte defectuoso de transporte mutante del receptor de glutamato y la división Q neuroblast celular. Los datos obtenidos de tales películas muestran que la inmovilización de microfluidos es un medio útil y exacta de la adquisición de los datos in vivo de eventos celulares y subcelulares en comparación con los animales anestesiados (Figura 1J y 4 3C-F).

Las dimensiones del dispositivo se han alterado para permitir imágenes a intervalos de tiempo de las diferentes etapas de C. elegans, Drosophila primer instar de larvas y larvas de pez cebra. El transporte de vesículas marcados con sinaptotagmina etiquetado con GFP (syt.eGFP) en las neuronas sensoriales muestra un movimiento dirigido de marcadores vesículas sinápticas colinérgicas expresados ​​en las neuronas sensoriales intactas larvas de primer instar Drosophila. Un dispositivo similar se ha utilizado para llevar a cabo el tiempo de imágenes a intervalos de latido del corazón en ~ 30 horas después de la fertilización (hpf)pez cebra larvas. Estos datos muestran que los dispositivos simples que hemos desarrollado puede ser aplicado a una variedad de sistemas modelo para estudiar varios fenómenos biológicos celulares y de desarrollo in vivo.

Protocolo

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1. SU8 Maestro de Fabricación

  1. Diseño de las estructuras de microfluidos con software Clewin e imprimirlo utilizando 65.024 plotter láser DPI con dimensión mínima de 8 m en la película placa de circuito.
  2. Limpiar 2 cm X 2 cm obleas de silicio con óxido nativo en KOH al 20% durante 1 min y enjuague con agua desionizada; cada una oblea para la capa de flujo y su capa de control correspondiente.
  3. Secar las piezas con gas nitrógeno y se deshidratan en una placa caliente a 120 ° C durante 4 horas. Permitir que las piezas se enfríen a temperatura ambiente antes de proceder a la siguiente etapa.
  4. Colocar las piezas de silicio de una en una en el plato giratorio y girar en el vacío. Cubrir las superficies de silicio con ~ 20 l hexametil-disilazano (HMDS) y recubrirlos con una. SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 3.000 rpm durante 30 sec
  5. Cubra las obleas de silicio totalmente con ~ 1,5 ml de SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) y obleas capa utilizando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 2.000 rpm durante 30 sec. Este protocolo hilado produce un espesor fotorresistente de ~ 40 m que es adecuado para el control de flujo y las capas para las primeras etapas de larvas de C. elegans.
  6. Centrifugación ~ 1,5 ml SU8-2050 usando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 2.000 rpm durante 30 segundos para obtener un espesor fotorresistente de ~ 80 m que es adecuado para la fabricación de flujo de la capa para fines de estadios larvales de C. elegans, capa de flujo basal para Drosophila / pez cebra larvas y sus capas de control correspondientes.
  7. Coloque las piezas de silicio en la placa caliente con la capa SU8 revestido en la parte superior. Soft cocer las piezas de silicio recubiertas a 65 º C durante 1 min seguido por 95 º C durante 10 min. Permitir que las piezas se enfríen a temperatura ambiente antes de proceder a la siguiente etapa.
  8. Coloque las piezas de silicona suave al horno en el escenario de exposición con SU8-2025 recubierto surcara en la parte superior frente a la lámpara UV. Utilice la máscara foto con diseño I (L1, figura 1B) y el diseño II (L2, Figura 1B) para la capa de flujo y el patrón de la capa de control, respectivamente, para los primeros estadios larvarios de C. elegans. Coloque la máscara foto en la parte superior de la capa de SU8 y asegurar la máscara es plana contra la capa de recubrimiento. Abra el obturador de la lámpara UV y exponer las suaves horneados SU8 obleas de hasta 200 vatios de la lámpara UV a través de la máscara de foto durante 15 s.
  9. Utilice la máscara foto con diseño I (L1, figura 1B) y el diseño II (L2, Figura 1B) en SU8-2050 piezas recubiertas (preparado en el paso 1,6) para la fabricación de la capa de flujo y la capa de control para fines de estadios larvales de C. elegans. Utilice la máscara foto con el diseño I (L1, figura 1C) y el diseño II (L2, Figura 1C) para la capa basal y la capa de flujo de control, respectivamente, para Drosophila / pez cebra larvas en las obleas recubiertas con SU8-2050 (preparado in paso 1,6). Exponer las superficies de SU8 través de la máscara foto a la lámpara UV de 200 vatios durante 15 segundos.
  10. Coloque los trozos de silicio expuesto sobre una placa caliente con la capa de revestimiento en la parte superior. Publica hornear las obleas a 65 ° C durante 1 min seguido por 95 º C durante 10 min. Permitir que las piezas se enfríen antes de proceder al siguiente paso.
  11. Desarrollar las piezas con la solución de revelado SU8 durante 20 min. Enjuague las piezas en alcohol isopropílico (IPA) y secado de gas con nitrógeno.
  12. Coloque los trozos de silicio en un desecador con el patrón de SU8 en la parte superior. Recubrir las piezas con 50 l de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor en un desecador durante 2 hr.

Precauciones: Tome las precauciones de seguridad para el manejo de sustancias químicas durante el tratamiento KOH, capa fotosensible y en desarrollo. Silano revestimiento vapor debe realizarse dentro de un desecador en un área ventilada. Proteja SU8 resistir de la exposición excesiva a la luz. Utilice gafas de protección UV con una light fuente.

2. PDMS fabricación de moldes

  1. Preparar 10:01 PDMS mediante la combinación de 50 g de Sylgard 184 base con 5 g de agente de curado en una taza de plástico. Mezclar el contenido manualmente para ~ 3 min. Desgasificar la mezcla dentro de un desecador para eliminar todas las burbujas de aire formadas durante la mezcla.
  2. Verter una mezcla de 5 mm de espesor PDMS sobre las obleas de silicio con SU8 patrón de diseño II, para la capa de control, con cuidado para evitar la formación de burbujas de aire. En caso de que se forman burbujas durante el vertido, desgasificar el PDMS en el patrón de SU8 en bajo vacío para eliminar todas las burbujas.
  3. Coloque las obleas de silicio con SU8-2025 patrón de diseño que, para la capa de flujo, el plato giratorio y encienda la aspiradora para sostenerlos. Cubrir las obleas con ~ 1 ml de mezcla de PDMS y capa de las obleas utilizando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 1.500 rpm durante 30 sec.
  4. Escudo ~ 1 ml PDMS mezcla en obleas de silicio con el 80 micras SU8-2050 patrón de diseño I (L1, figura 1B), para laflujo de la capa para finales de estadios larvales de C. elegans utilizando el spinner SPIN150 a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 1.000 rpm durante 30 sec. Escudo una gruesa capa de mezcla PDMS sobre las piezas de silicio con SU8-2050 modelo de flujo de diseño I capa (L1, figura 1C) para Drosophila / pez cebra, usando larvas SPIN150 spinner a 500 rpm durante 35 seg.
  5. Hornee piezas PDMS recubiertos de silicio del diseño I y obleas con diseño correspondiente II para el control de la capa que contiene PDMS para C. elegans y / o Drosophila / pez cebra larvas en un horno de convección de aire caliente a 50 ° C durante 6 horas.
  6. Cortar la pieza de PDMS del sustrato de silicio que contiene el patrón II SU8 de C. elegans y / o larvas de Drosophila / pez cebra con una cuchilla afilada. Un pequeño orificio de diámetro 1 ~ mm en la parte superior del depósito de conectar la trampa principal en el molde de PDMS usando un golpeador Harris.
  7. Coloque el bloque perforado PDMS (que contiene el molde 40 m de espesor para el controlcapa L2) en una bandeja de plástico, con el lado de moldeado de la capa de control hacia arriba. Coloque la oblea de silicio recubierto de PDMS que contiene los 40 m de grosor SU8 I diseño en la misma bandeja, con la superficie recubierta hacia arriba PDMS. Introduzca la bandeja en el interior de la cámara de limpiador de plasma y encienda el vacío durante 2 min. A continuación, encienda el plasma y reducir la presión en la cámara hasta que la cámara se vuelve rosa de color claro. Exponga las dos superficies a 18 vatios aire plasma al vacío bajo durante 2 min.
  8. Coloque el bloque perforado PDMS retirados de las 80 micras de espesor que contiene SU8 maestro II modelo para finales de estadios larvales de C. elegans o Drosophila / pez cebra larvas en una bandeja de plástico, con el lado de moldeado de la capa de control hacia arriba. Coloque el correspondiente giro al horno PDMS capa revestida en la oblea de silicio que contiene 80 micras de espesor diseño I para más tarde C. elegans etapas o Drosophila / pez cebra larvas simultáneamente en la misma bandeja con el plano s recubierto PDMSurface hacia arriba. Utilice el mismo protocolo mencionado anteriormente para exponerlos al aire plasma.
  9. Coloque las dos superficies tratadas por plasma C. elegans y / o Drosophila / pez cebra larvas junto con una presión suave y hornear en horno de convección de aire caliente a 50 ° C durante 2 horas.
  10. Cortar los dispositivos enlazados desde el sustrato de silicio con diseño I SU8 de C. elegans y / o larvas de Drosophila / pez cebra. Perforar orificios de acceso a los depósitos de entrada y de salida del canal de flujo.
  11. Coloque el molde en condiciones de servidumbre PDMS en una bandeja de plástico para C. elegans, con la parte de trazado del diseño de la capa de flujo hacia arriba. Limpie el vidrio cubreobjetos (22 x 22 mm, No. 1 espesor) y colocarla en la bandeja de plástico mismo. Inserte la bandeja que contiene el molde de PDMS y antideslizante cubierta de vidrio en el interior de la cámara de plasma. Exponer la superficie inferior del dispositivo de PDMS y el deslizamiento de vidrio cubierta de 18 vatios de plasma de aire a baja presión durante 2 min. Coloque las dos superficies tratadas con plasma genpresión TLE y hornear en horno de convección de aire caliente a 50 ° C durante 2 horas.
  12. Guarde el dispositivo en un entorno limpio para su uso futuro.

3. Pasos adicionales para Drosophila / Pez cebra dispositivo

  1. Exponer la superficie de vidrio limpio de tamaño de 2 cm X 2 cm de altura con 50 l de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor en un desecador durante 2 hr.
  2. Centrifugación ~ 1 ml de 10:1 mezcla PDMS preparada en la etapa 2,1 en la superficie de vidrio silanizada usando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 35 seg. Hornear los sustratos de vidrio recubiertas de PDMS en un horno de aire caliente a 50 ° C durante 6 horas con la superficie recubierta hacia arriba. Permitir que la capa de PDMS que se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder a la siguiente etapa.
  3. Ponche de la capa de revestimiento utilizando una costumbre golpeador construido de metal afilado en el medio de la PDMS, para formar la capa de separación PDMS. La forma de la perforadora de metal está diseñado similar al diseño de flujo para Drosophila / pez cebra (L1, figura 1C ).
  4. Exponer la capa separadora PDMS y de un solo bloque de servidumbre (capa y capa de control de flujo, en el paso 2.9 para Drosophila / pez cebra larvas) a 18 vatios limpiador de aire de plasma utilizando el plasma en vacío bajo. Colocar las dos superficies de plasma tratado juntos y hornear en un horno de aire caliente a 50 ° C durante 2 horas.
  5. Cortar el dispositivo unido desde el vidrio, agujeros de acceso en los depósitos de entrada y salida y el enlace a un cubreobjetos de vidrio (22 X 22 mm, N º 1 espesor) usando un limpiador de plasma como se ha mencionado en el paso 2,11. Esto produciría un dispositivo de inmovilización para el primer instar de larvas de Drosophila con una altura de canal de ~ 500 micras. Para las larvas de pez cebra, duplicar la capa espaciadora PDMS proceso de fabricación con una etapa de unión adicional. La doble capa de PDMS-S produce una altura de canal de 900 m para 30 HFP larvas de pez cebra.

Precauciones: Evitar las partículas de polvo durante la fabricación del dispositivo. Dos plasma superficie limpiadas que estar completamente libre de polvo para la correcta adherencia. La tienda de los dispositivos en un desecador en situaciones en las que una habitación limpia especial no está disponible con el fin de minimizar la acumulación de partículas de polvo en los dispositivos.

4. Con membrana de PDMS

  1. Conectar un extremo de un tubo de micro-flex (diámetro interno 1,6 ~ mm, diámetro exterior ~ 4,8 mm) a un regulador de suministro de gas nitrógeno a presión y el otro extremo al depósito trampa principal a través de una aguja de calibre 18 (diámetro exterior ~ 1,25 mm) pegados al tubo. Una llave de paso 3-way utilizado en el medio de la conexión del tubo permite la aplicación o liberación de la presión sobre la membrana.
  2. Llenar el tubo conectado al dispositivo de PDMS con una columna de 10 cm de agua destilada antes de conectarlo al depósito de la trampa principal de una C. elegans y / o Drosophila / pez cebra dispositivo larvas.
  3. Girar la válvula de la fuente de nitrógeno a 14 psi leer y controlar la membrana de la trampa principal desviando hacia the canal de flujo a bajo aumento de un microscopio invertido. Longitud de la columna de agua en el tubo de micro-flex se comprime cada vez que la llave de paso de 3-vías está abierta. Los bordes de la membrana desviados son visibles en luz transmitida (Figura 1I y 1J). Deflexión membrana provoca el desplazamiento de las partículas de polvo / burbujas en la membrana de PDMS y los empuja a los límites de los canales.
  4. Espere hasta que el frente del líquido llena el microcanal completamente sin aire atrapado.
  5. Libere la presión mediante el uso de la llave de paso de 3 vías para relajar la membrana en su posición de reposo.

5. Inserción C. elegans, Drosophila y larvas de pez cebra en el dispositivo y los inmoviliza Bajo la membrana flexible PDMS

  1. Rellene el canal de flujo con M9 buffer [3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O a 1 L, esterilizar en autoclaving] para C. elegans 18 o 1X PBS [8 g de NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4, H 2 O para 1 L, esterilizar en autoclave] para Drosophila / pez cebra larvas 19 durante 10 min antes de una experimento.
  2. Localizar un solo C. elegans de etapa requerida en una placa NGM 18 (o de primer instar de larvas de Drosophila de la placa de agar huevo o manualmente dechorionated 30 larvas de pez cebra hpf en medio líquido 20) utilizando un microscopio estereoscópico de baja magnificación. Elija un solo animal usando un pequeño volumen de solución tampón en una punta de micro. Utilice una punta de micro con su extremo cortado para dar cabida a la mayor Drosophila o larvas de pez cebra en el buffer.
  3. Empuje el único organismo a través de la boca del canal de flujo. Ajustar la presión de pipeteado para colocar el animal en la trampa principal.
  4. Aumentar la presión de la membrana de PDMS lentamente a la posición del animal contra la channel límite e inmovilizarlo con la presión de psi 14 para C. elegans, 7 psi para Drosophila y 3 psi para las larvas de pez cebra.
  5. La posición del animal inmovilizado en el centro del campo de vista microscópico. El uso de un microscopio invertido con los ajustes deseados para alta resolución campo brillante o imágenes de fluorescencia. Adquirir imágenes de fluorescencia simple o lapso de tiempo a frecuencia de imagen predefinida.
  6. Libere la presión trampa y controlar la locomoción de los animales durante 5-10 min a bajo aumento.
  7. Enjuague el animal e inserte un animal fresco para repetir los pasos anteriores.
  8. Lavar todos los animales desde el depósito de residuos utilizando agua destilada aplicada usando una jeringa. Secar el canal empujando el aire con una jeringa para la reutilización futura.

Precauciones: Animales que requieren una mayor presión para pipetear líquidos dentro del cauce principal tienden a mostrar locomoción pobres / de salud después de salir de la trampa y se debe evitar por imaGing. Limpiar el canal de flujo de cualquier rastro de tampón para evitar la obstrucción de canal por los cristales. Si se utiliza aceite para obtener imágenes de alta resolución, limpiar el cubre de vidrio a ser capaz de mantener buena relación señal ruido para posteriores experimentos.

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Resultados

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El dispositivo de inmovilización es una bicapa bloque PDMS fabricado mediante la unión de dos capas: una capa de flujo (capa 1) y una capa de control (capa 2) como se muestra en la figura 1. La trampa principal está conectado a un cilindro de gas nitrógeno a través de un regulador y una válvula de cierre 3-way para aplicar necesario (3-14 psi) de presión sobre la membrana a través de una columna de líquido (Figura 1A). La membrana desviada inmoviliza C. elegans, Drosophila o de...

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Discusión

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PDMS dispositivos microfluídicos son ópticamente transparentes por lo tanto se puede utilizar para la alta resolución en imágenes in vivo de cualquier organismo modelo transparente / translúcido. Nuestro diseño es adecuado para una gran ampliación espacio-temporal de imágenes de eventos celulares y subcelulares de animales vivos intactos. Microfabrication utilizando técnicas litográficas blandas permite la fácil manipulación de las dimensiones del dispositivo para diferentes tamaños de organismos model...

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Agradecemos al Dr. Ray Krishanu para las poblaciones de Drosophila, Tarjani Agarwal para el mantenimiento de una jaula de Drosophila, Peter Juo para nuIs25 CGC y de C. elegans cepas. SPK jsIs609 hecho en el laboratorio de Nonet de Michael. Damos las gracias a Arpan Agnihotri (BITS Pilani) por su ayuda en time-lapse de transporte mitocondrias de los animales jsIs609 en dispositivos de microfluidos. Estamos muy agradecidos con el Dr. Vatsala Thirumalai Surya Prakash y por darnos embriones de pez cebra. Damos las gracias a la Dra. Krishna y CIFF en BCN para uso del microscopio confocal de disco giratorio apoyado por el Departamento de Ciencia y Tecnología-Centro para la Nanotecnología (N º SR/55/NM-36-2005). También damos las gracias Kaustubh Rau, V. y Venkatraman Sachidanand Chetana para los debates. Este trabajo fue financiado por el DBT beca posdoctoral (SM), DST vía rápida esquema (SM) y una subvención a DBT (SPK). SA fue apoyado por becas de horario de verano y el CSIR a SPK.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
Las obleas de silicio Universidad oblea 150 mm (100) Mech Grado SSP Si
Clewin Software WieWeb software Versión 2.90
Plotter láser Imagen Fine Line 65.024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Revelador Microchem SU8 desarrollador
Silano Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow Corning Sylgard 184
Lámpara UV Mirador 66943 200W Hg Oriel Light
Horno de aire caliente Instrumentos Ultra Una medida que se A 50 ° C
Parrilla Equipos de laboratorio IKA 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hilandero Sistemas de producción de semiconductores SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Vidrio cubreobjetos Sello de Oro 22 X 22 mm, N º 1 espesor
C. elegans Caenorhabditis Centro de Genética (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P {} chaGAL4 / cyo, UAS-syt.eGFP
Pez cebra Tipo salvaje de la India Wild tipo
Tygon tubo Sigma Z279803
Micro aguja Sigma Z118044 Cortar en trozos de 1 cm
3-way llave de paso Sigma S7521
Harris pegador Sigma Z708631
El gas comprimido nitrógeno Proveedor local de gas Utilice un regulador para controlar la presión
Microscopio estéreo Nikon SMZ645
Microscopio confocal Andor y Olympus Yokogawa hilado disco microscopio confocal
ImageJ Los Institutos Nacionales de la Salud www.rsbweb.nih.gov / ij Java programa basado en el procesamiento de imágenes

Referencias

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