Simples dispositivos de microfluidos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Y pez cebra

Sudip Mondal; Shikha Ahlawat; Sandhya P. Koushika

doi:10.3791/3780

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Artículo de método

Simples dispositivos de microfluidos para

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DOI:

10.3791/3780

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30 de septiembre de 2012

Sudip Mondal¹ , Shikha Ahlawat¹ , Sandhya P. Koushika¹^,²

¹Neurobiology, NCBS-TIFR, ²Department of Biological Sciences, TIFR

En este artículo

Resumen

Un dispositivo microfluídico simple ha sido desarrollado para realizar anestésico libre In vivo Formación de imágenes de C. elegans, Intacto Drosophila Larvas y larvas de pez cebra. El dispositivo utiliza una membrana de PDMS deformable para inmovilizar estos organismos modelo con el fin de realizar las imágenes de lapso de tiempo de numerosos procesos, tales como el ritmo cardíaco, la división celular y subcelular transporte neuronal. Se demuestra el uso de este dispositivo y muestran ejemplos de diferentes tipos de datos recogidos a partir de sistemas de modelos diferentes.

Resumen

Micro fabricadas dispositivos fluídicos proporcionar un micro-entorno accesible para estudios in vivo de pequeños organismos. Procesos de fabricación sencillos están disponibles para los dispositivos de microfluidos con técnicas de litografía blanda ^1-3. Los dispositivos microfluídicos se han usado para la sub-celular de imagen ^4,5, in vivo microcirugía láser ^2,6 y ^4,7 celular formación de imágenes. Imágenes in vivo requiere la inmovilización de los organismos. Esto se ha logrado mediante succión ^{5,8, 6,7,9} canales cónicos, membranas deformables ^2-4,10, succión con refrigeración adicional ^5, anestésico gas ^11, geles sensibles a la temperatura ^{12, 13} y pegamento de cianoacrilato anestésicos tales como levamisol ^{14 , 15.} Anestésicos usados comúnmente influir en la transmisión sináptica ^16,17 y se sabe que tienen efectos perjudiciales sobre la sub-celular neuronal transporte ^4. En este study demostramos una membrana basada poli-dimetil-siloxano (PDMS), dispositivo que permite la inmovilización anestésico libre de organismos modelo intactas genéticos tales como Caenorhabditis elegans (C. elegans), larvas de Drosophila y larvas de pez cebra. Estos organismos modelo son adecuados para estudios in vivo en los dispositivos de microfluidos a causa de sus pequeños diámetros y cuerpos ópticamente transparentes o translúcidos. Diámetros del cuerpo van desde ~ 10 ~ 800 micras para micras para los primeros estadios larvales de C. elegans y larvas de pez cebra y requieren dispositivos de microfluidos de diferentes tamaños para lograr una inmovilización completa de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo. Estos organismos se inmovilizan mediante presión aplicada por gas nitrógeno comprimido a través de una columna de líquido y fotografiado usando un microscopio invertido. Animales liberados de la trampa de volver a la locomoción normal dentro de 10 min.

Demostramos cuatro aplicaciones de time-lapse en C. elegansa saber, el transporte mitocondrial de imágenes en las neuronas, presináptica transporte de vesículas en un transporte defectuoso de transporte mutante del receptor de glutamato y la división Q neuroblast celular. Los datos obtenidos de tales películas muestran que la inmovilización de microfluidos es un medio útil y exacta de la adquisición de los datos in vivo de eventos celulares y subcelulares en comparación con los animales anestesiados (Figura 1J y ⁴ 3C-F).

Las dimensiones del dispositivo se han alterado para permitir imágenes a intervalos de tiempo de las diferentes etapas de C. elegans, Drosophila primer instar de larvas y larvas de pez cebra. El transporte de vesículas marcados con sinaptotagmina etiquetado con GFP (syt.eGFP) en las neuronas sensoriales muestra un movimiento dirigido de marcadores vesículas sinápticas colinérgicas expresados en las neuronas sensoriales intactas larvas de primer instar Drosophila. Un dispositivo similar se ha utilizado para llevar a cabo el tiempo de imágenes a intervalos de latido del corazón en ~ 30 horas después de la fertilización (hpf)pez cebra larvas. Estos datos muestran que los dispositivos simples que hemos desarrollado puede ser aplicado a una variedad de sistemas modelo para estudiar varios fenómenos biológicos celulares y de desarrollo in vivo.